逆轉(zhuǎn)錄試劑盒組分確保高效、高靈敏的Real-Time RT-PCR

原理

為獲得準(zhǔn)確的real-time RT-PCR基因表達(dá)分析結(jié)果，很重要的是僅擴增和檢測cDNA?；蚪MDNA的干擾可通過設(shè)計橫跨外顯子/外顯子邊界的引物或探針避免。盡管如此，在某些特殊情況下（如：cDNA來自一個單外顯子基因），起始RNA樣品必須無基因組DNA。

使用QuantiTect Reverse Transcription Kit，基因組DNA污染物可使用*的gDNA去除緩沖液迅速有效的去除（見圖：“高效去除基因組DNA，確保精確的Real-Time RT-PCR”）。因為純化RNA樣品后無需另外采用DNA酶消化，從而可節(jié)省時間和費用。并且也無需設(shè)計RNA特異性引物和探針。

低豐度轉(zhuǎn)錄本獲得更高產(chǎn)量的cDNA

應(yīng)用Real-time，兩步法RT-PCR 分析IL12A 和IL1RN，起始RNA量不同 。應(yīng)用QuantiTect Reverse Transcription Kit 或來自供應(yīng)商Supplier A_II的試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總 RNA 。在 ABI PRISM 7900 上應(yīng)用的QuantiTect Probe PCR Kit 、IL12A或 IL1RN的 QuantiTect Gene Expression Assays 分析合成的。 應(yīng)用凱杰試劑盒C_T值較低，尤其中等豐度的基因IL12A（粗體），cDNA產(chǎn)量更高。N.D.：未檢測（Not detected）。

RT Primer Mix包含有特別優(yōu)化的oligo-dT和隨機引物的混合物，使cDNA合成可從RNA轉(zhuǎn)錄本的各個區(qū)域起始，甚至可從5'區(qū)域開始（見圖：“高靈敏度檢測12.5 kb 轉(zhuǎn)錄本5'區(qū)域的靶分子”）。相對于其他供應(yīng)商提供的試劑盒來說，QuantiTect Reverse Transcription Kit為real-time PCR分析提供高產(chǎn)量的cDNA，無需考慮待擴增目標(biāo)序列位于轉(zhuǎn)錄本的哪個區(qū)域。同時，QuantiTect Reverse Transcription Kit也確保了real-time RT-PCR結(jié)果更好的重復(fù)性。

操作流程

使用QuantiTect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒可在20分鐘內(nèi)去除基因組DNA和合成cDNA（見流程圖）。由于兩個反應(yīng)均在同一孵育溫度并使用預(yù)混液構(gòu)建反應(yīng)，因此操作過程快速且方便。相反，供應(yīng)商I提供的試劑盒操作需更多移液步驟且經(jīng)常需要調(diào)整孵育溫度，因此需要更長時間和更多手動操作。

應(yīng)用

QuantiTect Reverse Transcription Kit可從各種類型的起始樣品中合成cDNA以實現(xiàn)高效和高靈敏度的real-time RT-PCR，包括激光顯微切割樣品和活組織切片樣品。與其他供應(yīng)商提供的試劑相比，QuantiTect Reverse Transcription Kit在檢測低豐度基因時具有更高的靈敏度（見圖：“Real-Time，兩步法RT-PCR精確度更高”）。

為獲得高特異性和高靈敏度的real-time RT-PCR結(jié)果，又避免耗時的反應(yīng)步驟優(yōu)化過程，我們推薦QuantiTect Reverse Transcription Kit和其他QuantiTect產(chǎn)品聯(lián)合使用。包括經(jīng)優(yōu)化的PCR反應(yīng)預(yù)混液和即用型引物，使用SYBR Green染料法或序列特異性探針法進(jìn)行 real-time RT-PCR。