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   zui近由于自己接觸微生物的發(fā)酵生產(chǎn)，在學(xué)習(xí)的過程中收集了一些資料結(jié)合自己的實際生產(chǎn)情況，把自己覺得比較好用的資料與大家分享一下，下面的例子是以蘑菇為例的，跟其他細菌的分離方法是同個道理
     
     菌種分離即是進行蘑菇菌絲的純化過程，它是制種工作的重要環(huán)節(jié)，通俗講是把蘑菇菌絲從自然界中單獨分離出來進行純培養(yǎng)，從而獲得純蘑菇菌絲生長的菌種。蘑菇菌種的分離方法有三種：即孢子分離、組織分離和基質(zhì)菌絲分離法。
     一、孢子分離法
     　　蘑菇孢子分離法，是利用成熟子實體的有性擔(dān)孢子能自動從子實體層中彈射出來的特征，在無菌條件下和適宜的培養(yǎng)基上，使孢子萌發(fā)成菌絲，獲得純種的一種方法。孢子分離可分為單孢分離和多孢分離法兩種，由于是從有性擔(dān)孢子（是指其細胞核已經(jīng)地核配過程）分離純菌絲體，因此生產(chǎn)上多采用多孢分離法來保持菌株的原有特性，而單孢分離法主要應(yīng)用于菌株的篩選和雜交育種等工作，孢子分離主要分為兩個步驟，首先是采集孢子，其次進行單孢或多孢子分離。
     （一）采集孢子
     １、種菇的選擇　采集孢子首先要選好種菇即分離用的子實體。一般蘑菇種菇要求是*潮菇，出菇較早，單生，個體健壯，特征典型的子實體，經(jīng)過仔細的觀察篩選后在菇床上做個記號，讓種菇充分生長，直至即將破膜時將菇采摘進行孢子彈射。
     ２、孢子彈射收集　種菇采收后可浸入0.1%升汞溶液中消毒約一分鐘，用鑷子取出后經(jīng)無菌水沖洗數(shù)次，再用無菌濾紙把表面水吸干，或直接用75% 酒精棉球輕輕控拭菌蓋及菌柄進行表面消毒。隨后用無菌刀切掉多余菌柄（約留下1.5-2cm即可），把菇直立，菇柄朝下插入鋁線制作的支持物上，放入了先準(zhǔn)備好鋪有無菌濾紙條的平皿上，蓋上鐘罩（如圖　所示）。這套孢子收集裝置需事*行高壓滅菌消毒。把裝好子實體的孢子彈射收集器放在溫度為15-20℃的室內(nèi),經(jīng)24-48小時左右， 可見到無菌濾紙上有褐色的蘑菇孢子印。在無菌操作下把收集到蘑菇孢子的濾紙條裝入無菌的空試管中，并在溫度下進行真空干燥，之后放入冰箱可長期保存?zhèn)溆谩?
     （二）孢子分離
     １、多孢分離法　即把多個孢接種在同一培養(yǎng)基上，讓它們萌發(fā)共同生長交錯在一起，從而獲得純種的一種方法，由于多個孢子間的種性互補，基本上可以保持親本的穩(wěn)定性，此法比較簡易，在過去的蘑菇制種中應(yīng)用較為普遍。
     （１）斜面劃線法：按無菌操作規(guī)程，用無菌接種環(huán)從收到孢子的濾紙條上沾取少量孢子，在PDA試管斜面培養(yǎng)基上自下而上劃線，劃線時勿用力， 以免劃破培養(yǎng)基表面，接種完畢，抽出接種種灼燒試管口，塞上棉塞，放置24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待孢子萌發(fā)后（一般約15-20天），挑選萌發(fā)快，長勢旺的菌落， 轉(zhuǎn)接于新試管培養(yǎng)基上再行培養(yǎng)。
     （２）涂布分離法：按無菌操作方法，取一小塊具有孢子的濾紙條，放入裝有無菌水的小三角瓶中，充分搖勻制成孢子懸浮液，然后用已滅菌的試管，吸取孢子懸浮液，滴1-2滴到PDA試管或培養(yǎng)皿培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動試管使孢子懸浮液均勻分布于斜面上，或用玻璃涂布棒將平板上的懸浮液涂布均勻。孢子在培養(yǎng)基上經(jīng)24℃恒溫培養(yǎng)萌發(fā)后，挑選幾株發(fā)育勻稱，生長速度快的菌落，移接于另一試管斜面培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)即為母種。
     ２、單孢分離　就是將采集到的孢子群單個分開進行培養(yǎng)，讓它單獨萌發(fā)成菌絲而獲得純種的方法，單孢子分離的方法，按分離的手段可分為以下三種。
     （１）稀釋分離法：這是通過不斷稀釋孢子懸浮液，使孢子分散zui終孢子濃度控制在300-500個孢子/毫升,吸取0.1毫升的孢子液注入平板均勻涂布，分散孢子各自萌發(fā)形成單孢菌落，其步驟如下：
     ①制備無菌水試管:取10支試管,其中1支裝100毫升蒸餾水,其它9支裝9毫升蒸餾水,經(jīng)高壓滅菌即成無菌水。
     ②制孢子懸液：取一小塊收集有孢子的濾紙條，浸入10毫升無菌水試管中, 搖振使孢子分散成懸液,用無菌1毫升移液管吸取1毫升孢子懸液于第2支試管中, 搖振使其分期,再從第2支試管中吸取1毫升注入第3支試管中, 如此反復(fù)稀釋直到孢子濃度達到300-500個孢子/毫升,備用。
     ③制培養(yǎng)基平板：配制PDA培養(yǎng)基,裝入三角瓶中進行高壓滅菌, 準(zhǔn)備倒平板的培養(yǎng)皿也經(jīng)過高壓滅菌備用,待已滅菌的PDA冷卻至50-60℃時,在無菌操作下倒15-20 毫升PDA至培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)皿放平,晝使培養(yǎng)基表面光滑,厚度一致。
     ④孢子涂布：在無菌操作下，吸取0.1毫升的孢子懸浮液滴在平板培養(yǎng)基表面上,使用T氏棒把孢子均勻涂布在平板上,蓋上刺激菌絲培養(yǎng)皿,放置于24-25℃恒溫箱中培養(yǎng)。
     ⑤挑選單孢子萌發(fā)菌落：一般孢子經(jīng)過５天的培養(yǎng)開始萌發(fā)長出菌絲，培養(yǎng)皿經(jīng)過顯微鏡的鏡檢確定孢子萌發(fā)的菌落是由單個孢子萌發(fā)成長而成的，可使用打孔器進行打孔把該菌落移接至新鮮的PDA斜面試管中繼續(xù)培養(yǎng)。 打孔器的外徑應(yīng)小于顯微鏡的視野范圍，而且打孔之前須檢查該菌落周圍是否有孢子或其它菌落，晝使打孔不會觸及周邊的孢子或菌落，確保純種。
     （２）毛細管法：孢子懸浮液經(jīng)過稀釋，使用毛細滴管把孢子懸浮液滴一小滴于皿蓋內(nèi)，晝使每一滴只含有一個孢子，從而達到單孢子分離，其方法如下：
     ①孢子懸浮液制備同稀釋分離法，孢子濃度控制在200-300個孢子/毫升。
     ②毛細滴管制備:取潔凈的玻璃管在酒精噴燈上先拉成外徑1毫米的細管, 稍冷卻后再加熱并迅速拉長,使管尖內(nèi)徑約200微米,剪斷即成毛細滴管,在滴管后端塞棉花, 裝入消毒盒中后進行滅菌備用。
     ③點樣鏡檢：用毛細滴管吸取經(jīng)稀釋的孢子懸浮液約0.1毫升(可滴30滴),在無菌操作下,快速點于皿蓋內(nèi)壁的標(biāo)記圈中央,滴液應(yīng)小于低倍鏡的視野, 點樣后的培養(yǎng)皿仍蓋在有水瓊脂的皿底上,貼膠布固定后再用低倍銳檢查皿蓋內(nèi)壁的的液滴,確定是單孢者,即在皿蓋上標(biāo)上記號。
     ④培養(yǎng)基推貼及刺激培養(yǎng)：使用接種針取一小塊PDA培養(yǎng)基(約2×2毫米方塊) 推貼至標(biāo)記為單孢子的液滴,使液滴中的孢子能夠吸附到培養(yǎng)基邊緣。 將事先培養(yǎng)好蘑菇氣生菌絲的平板培養(yǎng)皿蓋取下，套在菌絲平板的底部，再把已分離并推貼好的培養(yǎng)基的皿蓋罩在套有菌絲平板的玻璃皿上，使兩個皿蓋對接，貼膠布封口(要留0.5厘米縫用作通氣),這樣就形成一個刺激單孢子萌發(fā)的培養(yǎng)室,置培養(yǎng)箱中24 ℃下培養(yǎng),待單孢子萌發(fā),及時撕下膠布,用接種鏟挑取已萌發(fā)的單孢菌絲貼塊,移接到新鮮PDA斜面試管中,置24℃恒溫箱中培養(yǎng),即可區(qū)得單孢純種。
     （３）器械分離法：應(yīng)用顯微操作器，直接挑選單孢子，移至PDA 平板中進行孢子刺激萌發(fā)培養(yǎng),獲得單孢純種。
     ①孢子懸浮液制備：同稀釋分離法，孢子濃度控制在1000個/毫升;
     ②平板涂布:將稀釋后的孢子懸浮液滴0.1毫升于平板上,用無菌的T氏棒進行均勻涂布,每個平板含孢子大約100個左右;
     ③鏡檢分離:待涂布均勻的平板瓊脂表面水分干燥后即可于顯微鏡下觀察,當(dāng)在視野中心見到孢子,而視野周圍無其它孢子時,可用顯微操作器操縱玻璃針把孢子從培養(yǎng)基表面挑取,隨后把孢子轉(zhuǎn)移至PDA平板的表面上,進行孢子萌發(fā)培養(yǎng),孢子萌發(fā)培養(yǎng)須使用蘑菇氣生菌絲刺激培養(yǎng),才能提高萌發(fā)率,培養(yǎng)的具體操作方法與涂布分離法相同。
     （４）單孢子菌落接待：當(dāng)孢子經(jīng)過10天的刺激培養(yǎng), 肉眼可見到菌絲生長而成小菌落,應(yīng)及時用打孢子器把該菌落分離,每天都應(yīng)觀察孢子萌發(fā)情況, 如果不及時把菌落移接,該菌落會快速生長而影響較遲萌發(fā)單孢子的分離。
     
     二、組織分離法
     　　組織分離法是利用子實體組織來分離獲得純菌絲的方法。組織分離系一種無性繁殖法，雙親的染色體沒有經(jīng)過重組，因此組織分離基本上可保持親本的生物不特性，棒操作簡便，取村廣泛，在過去傳統(tǒng)的穩(wěn)定菌株中常采用此方法進行菌種的分離，退化不明顯，但是隨著蘑菇雜交菌種的應(yīng)用，由于雜種本身所具有的不穩(wěn)定，組織分離常造成菌株的退化，目前生產(chǎn)上很少采用，只是進行野生菌株分離時，才比較常用。其方法如下：
     ①挑選種菇：其標(biāo)準(zhǔn)與孢子收集要求相同；
     ②菇體消毒：將子實體菌柄基部切除,置接種箱內(nèi),用75%酒精對菇體表面進行消毒;
     ③組織分離:*經(jīng)火焰滅菌,在菇柄中部縱切一刀, 用手掰開菌再用接種鏟在菇蓋與菇柄交界處切五個小方塊,隨后挑取一小塊組織,迅速移接到PDA斜面培養(yǎng)基上,置24℃下培養(yǎng),待組織塊長出菌絲無污染即為純種