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淺述蛋白質(zhì)分離純化的新技術(shù)

摘 要： 本文主要介紹了濁點(diǎn)萃取法、置換色譜法、親和層析法、親和色譜法、凝膠電泳、雙水相萃取等蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)，綜和近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的一些研究結(jié)果，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用的例子，分析了各種分離純化方法的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)指出其不足之處。文章zui后展望了蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

關(guān) 鍵 詞： 分離純化 蛋白質(zhì) 進(jìn)展

生物技術(shù)的發(fā)展非常迅速，基因工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)，已經(jīng)能設(shè)計(jì)、制造、生產(chǎn)人們急需的多種蛋白質(zhì)。 和其它生物產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程一樣蛋白質(zhì)的生產(chǎn)過(guò)程一般也分為上、中、下游過(guò)程。上、中游過(guò)程是運(yùn)用生物技術(shù)生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，下游過(guò)程是指對(duì)含有目標(biāo)產(chǎn)物的物料進(jìn)行處理、分離、純化、加工目標(biāo)產(chǎn)物。本文主要綜和近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果，介紹了蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)。

2. 蛋白質(zhì)的分離純化方法：
2.1 濁點(diǎn)萃取法（CPE）：
2.1.1 概念及原理：

濁點(diǎn)萃取法（cloud point extraction，CPE）〔1〕是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新興的液—液萃取技術(shù)，它不使用揮發(fā)性有機(jī)溶劑，不影響環(huán)境。它以中性表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點(diǎn)現(xiàn)象為基礎(chǔ)，改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)引發(fā)相分離，將疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分離。目前該法已成功地應(yīng)用于金屬螯合物、生物大分子的分離與純化及環(huán)境樣品的前處理中[2-5]。


CPE 法除了利用增溶作用外，還利用了表面活性劑另一個(gè)重要性質(zhì)——濁點(diǎn)現(xiàn)象。溶液靜置一段時(shí)間（或離心）后會(huì)形成兩個(gè)透明的液相：一為表面活性劑相（約占總體積的5％）；另一為水相（膠束濃度等于CMC）。外界條件（如溫度）向相反方向變化，兩相便消失，再次成為均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物質(zhì)如膜蛋白，與表面活性劑的疏水基團(tuán)結(jié)合，被萃取進(jìn)表面活性劑相，親水性物質(zhì)留在水相，這種利用濁點(diǎn)現(xiàn)象使樣品中疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分離的萃取方法就是濁點(diǎn)萃取。圖1顯示了由溫度變化引發(fā)的這種相分離現(xiàn)象。溫度的改變，引起水化層的破壞，增強(qiáng)了表面活性劑的疏水性。


2.1.2 蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用：
CPE 法可用于分離膜蛋白、酶、動(dòng)物、植物和細(xì)菌的受體，還可以替代一些分離方法如硫酸銨分級(jí)法作為純化蛋白的*步，與色譜方法聯(lián)用。另外，CPE 法分離純化蛋白質(zhì)已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模操作。Minuth等人成功地進(jìn)行了膽固醇氧化酶濁點(diǎn)萃取的中試研究。雖然使用離心分離器可以使CPE大規(guī)模連續(xù)進(jìn)行，但商品離心分離器用于CPE 的效率和容量仍需進(jìn)一步研究。而且，他們發(fā)現(xiàn)相分離操作受細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)影響較大，體系兩相間密度差較小，表面張力較小，含產(chǎn)物的表面活性劑相的流變學(xué)行為較復(fù)雜，操作較難。表1列出了CPE法近幾年來(lái)在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用。

（1） CPE法用于分離純化膜蛋白
膜蛋白（內(nèi)嵌膜蛋白、外圍膜蛋白）硫水性強(qiáng)、難溶于水，抽提內(nèi)嵌膜蛋白時(shí)，既要削弱它與膜脂的硫水性結(jié)合，又耍使它保持硫水基在外的天然狀態(tài)，較難分離純化。由于表面活性刑具有兩親性，它一直作為腹蛋白理想的增溶劑。增溶時(shí)，膜蛋白琉水部分嵌入膠束的硫水核中而與膜脫離，又保持了膜蛋白表面的廢水結(jié)構(gòu)。相分離后，膜蛋白與表面活性劑共同析出，與親水性蛋白質(zhì)分離。所以，CPE 法在分離純化膜蛋白方面極有優(yōu)勢(shì)。

（2） 與其它分析技術(shù)的聯(lián)用
CPE 可以作為液相色譜（HPLC）、流動(dòng)注射分析（FIA）、毛細(xì)管電泳（CE）等儀器分析的樣品前處理方法，提高檢出靈敏度。表面活性別可以防止樣品吸附在玻璃容器上，易于與FIA中的載液及HPLC中的有機(jī)流動(dòng)相或膠束流動(dòng)相混合，可以直接進(jìn)樣。但是在很多應(yīng)用中需要除去表面活性劑后再與儀器聯(lián)用。將萃取物與表面活性劑分離的方法很多。對(duì)于CMC＞1mM 的表面活性劑如兩性離子表面活性劑可用透析法，但操作時(shí)間較長(zhǎng)（24h左右）。對(duì)于CMC 較小的表面活性劑可通過(guò)色譜柱分離除去，如凝膠柱、毛紉管柱等，分離出的表面活性劑可以再利用，也可以作焚燒處理。但CPE作為HPLC 的樣品前處理方法有兩個(gè)缺點(diǎn)：*，常用的表面活性劑在UV區(qū)域有很強(qiáng)的背景吸收。第二，操作時(shí)間較長(zhǎng)，從色譜柱上需用幾個(gè)小時(shí)洗脫表面活性劑。表面活性劑的洗脫可能會(huì)干擾分析物的測(cè)定[3]。


2.2 置換色譜法：
2.2.1 概念及分離機(jī)理：
置換色譜（displacement chromatography）〔6〕作為一種非線性色譜技術(shù)，是指樣品輸入色譜柱后，用一種與固定相作用力*的置換劑（displacer）通人色譜柱，去替代結(jié)合在固定相表面的溶質(zhì)分子。樣品在置換劑的推動(dòng)下沿色譜柱前進(jìn)，使樣品中各組分按作用力強(qiáng)弱的次序，形成一系列前后相鄰的譜帶，并在置換劑的推動(dòng)下流出色譜柱[7]。置換色譜的分離行為與樣品組分和置換劑在實(shí)驗(yàn)條件下的吸附等濕線有直接的。置換色譜要求樣品組分及置換劑的吸附等濕線應(yīng)為L(zhǎng)angmuir 型，而且置換劑相對(duì)于被分離的各組分應(yīng)有zui強(qiáng)的吸附能力，其吸附等溫線位于所有組分的吸附等溫線的上方[7]，見(jiàn)圖1（A）。根據(jù)物料平衡方程，置換劑在柱中的移動(dòng)速度uD有下列關(guān)系：
式中uD 為流動(dòng)相的線速，ф為相比，qD 和cD 分別為置換劑在固定相和流動(dòng)相中的濃度，qD／cD 是直線OD的斜率，稱之為操作線（operating line）。當(dāng)操作線的斜率小于被分離組分等溫線的起始斜率，樣品才能進(jìn)行置換展開(kāi)，zui終形成如圖l（中的置換序列，這是在理想的情況下（假定無(wú)軸向擴(kuò)散及二次化學(xué)平衡）獲得的置換色譜圖。每一組分形成矩形的平臺(tái)（Plateau）洗脫峰，相鄰各組分的平臺(tái)洗脫峰組成了一個(gè)臺(tái)階


狀的色譜圖。此時(shí)，樣品中不同的組分以置換劑的速度前進(jìn)，即達(dá)到等速狀態(tài)（isobathic conditions）：
uD＝u2； u3＝u4
式中u2、u3、u4 指被置換的三組分的速度
2.2.2 影響置換色譜分離的因素：
（1）置換劑
置換劑的選擇是置換色譜能否成功地分離和純化目標(biāo)產(chǎn)物的關(guān)鍵因素之一〔7,8〕。對(duì)于蛋白質(zhì)生物大分子的置換色譜來(lái)說(shuō)，多離子型的置換劑與離子交換續(xù)料相結(jié)合是目前常用的分離方式。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為分子量相對(duì)大的聚電解質(zhì)是較合適的置換劑，因?yàn)樗鼈儗?duì)固定相的結(jié)合比分離物更強(qiáng)，如羧甲基葡聚糖（CMD）、
硫酸葡聚糖、羧甲基淀粉（CMS）〔9〕、硫酸魚精蛋、肝素、多硫酸戊聚糖（PPS）等。近期的研究表明，低分子量的化合物作為置換劑則更有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榧词怪脫Q劑與蛋白質(zhì)產(chǎn)物的峰有疊加，在后處理過(guò)程中，低分子量置換劑則較容易從目標(biāo)產(chǎn)物中分離；同時(shí)，合成低分子量置換劑成本較低，色譜柱再生過(guò)程也比分子量大的置換劑快。
（2）固定相
理想的固定相應(yīng)具備以下條件：樣品及置換劑在固定相上應(yīng)有較強(qiáng)的吸附作用，且吸附是可逆的；樣品及置換劑在固定相上的吸附等溫線應(yīng)為L(zhǎng)angmuir 型；樣品各組分在固定相上的吸附能力應(yīng)有較大差別，以保證置換色譜帶的交疊部分盡可能小而獲得良好的產(chǎn)率；有較好的化學(xué)穩(wěn)定性，可適用于不同pH 值的緩沖液和有機(jī)溶劑；有較大的比表面及吸附容量；有較好的機(jī)械強(qiáng)度，而且容易再生。置換色譜中的環(huán)境不同，置換效果也不一樣，即使是選用同樣的硅膠，由于來(lái)源和制備方法上的差異也會(huì)影響置換效率。反相
色譜中使用的烷基硅膠柱常被應(yīng)用于置換色譜。同其它硅膠固定相相比，烷基硅膠柱由于柱容量低及非選擇性吸附等缺點(diǎn)，很少被用于洗脫色譜，但它卻可以用于置換色諾，并成功地分離了對(duì)映異構(gòu)體。

1、問(wèn)題：電滲純化蛋白質(zhì)，結(jié)果幾乎沒(méi)得到蛋白，請(qǐng)問(wèn)哪位有高見(jiàn) 今夜純化蛋白，本以為唾手可得，結(jié)果卻大失所望....我用SDS-PAGE分離，KCL顯帶，割膠，而后電滲分離，測(cè)OD 值極低，請(qǐng)問(wèn)哪位有這方面的經(jīng)驗(yàn)或其它方法，望賜教。解決：多挖點(diǎn)膠，收集起來(lái)，放在1.5 離心管里，用PBS搗爛，4度 過(guò)夜。然后離心，收集上清即可。zui后，把上清凍成干粉。

2、問(wèn)題：蛋白質(zhì)提純的方法：
SDS-PAGE and N-terminal amino acid sequence analysis.（dahuaidang）SDS polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） was performed in 12% acrylamide and 0.1% SDS with adiscontinuous Tris-glycine buffer system. Purified enzyme was subjected to SDS-PAGE and electroblotted toImmobilo-PSQ 0.45μm polyvinylidene fluoride membrane （Millipore）. After the membrane was stained with
Ponceau S （Sigma）, the enzyme protein was cut out and washed with methanol. The membrane strip holding the protein was subjected to automatic Edman degradation for sequencing of the N-terminal aminol acids using an
Applied Biosystems 477A protein sequencer （Parkin Elmer）.

3、問(wèn)題：蛋白質(zhì)純化，裝柱，過(guò)柱應(yīng)注意事項(xiàng)有哪些？（dahuaidang）
現(xiàn)在要進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，有關(guān)裝柱和過(guò)柱的注意事項(xiàng)有哪些呀？還有，需要測(cè)序的蛋白質(zhì)樣品，大概需要多少，樣品要求有哪些。柱子sephadex-200,和DEAE-纖維互素。
*，手工裝柱一般只適宜于大量蛋白質(zhì)的提取。分子篩柱一般在鹽析以后用效率才高，因?yàn)樗姆宙聦?shí)?。以掫b葉莢蕹捎茫齲校蹋彌潁疲校蹋彌?Gelfitration column）.如果手工裝柱，長(zhǎng)度應(yīng)是內(nèi)徑的６０－８０倍，一般柱長(zhǎng)應(yīng)在1.2-2米，對(duì)于軟膠，走一次柱須１２小時(shí)以上，對(duì)硬膠，也需５－６小時(shí)。

第二，儀器檢測(cè)器靈敏度調(diào)整：zui重要的是確定儀器工作正常，信號(hào)相應(yīng)正常?？捎迷跈z測(cè)器出口通氣泡和檢測(cè)器入口注射有色樣品的方法確認(rèn)儀器正常和估計(jì)靈敏度。
第三，均勻, 無(wú)氣泡，平衡充分，分子篩要注意長(zhǎng)度與直徑比。測(cè)序的蛋白量' 我用的方法的量是SDS-PAGE


第四，如果是測(cè)序的話,跑SDS-PAGE,把染出的蛋白質(zhì)帶,挖下來(lái).,直接拿去做質(zhì)譜,只要你有錢國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心。還有就是要保證挖的是一個(gè)蛋白質(zhì)帶,不能含雜蛋白質(zhì)的,不然,把雜蛋白質(zhì)測(cè)了怎么辦。

第五，測(cè)序跟質(zhì)譜不是一回事兒的。做質(zhì)譜可以做分子量和質(zhì)譜圖，但是未必是序列。序列是要單測(cè)的。北大有位老師可以做：180塊錢一個(gè)氨基酸。做質(zhì)譜多得是：測(cè)分子量大約是450塊錢了，測(cè)圖譜的要一千多塊。

4、問(wèn)題：跑SDS-PAGE 有好多帶，而過(guò)柱時(shí)卻沒(méi)有峰，原因是什么？
1、會(huì)不會(huì)是洗脫太快。
2、查查有沒(méi)有斷層。
3、SDS-PAGE 分離能力強(qiáng), 而在柱子FRACTION 中幾個(gè)低峰依次串在一起就不明顯了。
4、上柱前樣品要濃縮，保證樣濃度不能太低。如沒(méi)濃縮，檢測(cè)儀的量程又沒(méi)選好，可能看不出來(lái)。

5、Sephadex 是Amersham 公司經(jīng)典的層析填料，有很高的選擇性，不同顆粒大小的填料有不同的分離范圍，主要用于凝膠層析（亦稱分子篩）。粗顆粒流速較快，細(xì)顆粒流速較慢，但分辨率較高。Sephadex 200的分離范圍（以球蛋白計(jì)）是5－60kDa。這種填料的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是較便宜。（也夠貴的） 現(xiàn)已被新一代Bioprocess填料代替。
DEAE--纖維素 我沒(méi)用過(guò)，應(yīng)該是用于離子交換吧。這是一種弱陰離子填料。

以下情況都是正常的：
1，沒(méi)有峰的部位有帶。可能吸收低上樣量少或者檢測(cè)手段不對(duì)頭（zui麻煩，好像只好分部收集了，但是一般情況下，首先考慮的是找到更合適的檢測(cè)手段）。
2，一個(gè)很好的峰的部位有很多帶。這個(gè)就沒(méi)有必要解釋了。
3，有峰的部位沒(méi)有帶?？赡苁怯凶贤馕盏男》种蛘呓到獾亩屉模ㄟ@個(gè)zui可恨）或者在電泳中間分子量太小跑到頂端了等等。

4，同一個(gè)蛋白出現(xiàn)在不同的部位。在離子交換中可能是電荷分布不對(duì)稱。上面的所有的還有一個(gè)可能就是柱子有問(wèn)題，那我就不好說(shuō)了。但是我用到的都是世界上的公司的預(yù)裝柱，所以我就不考慮了。還有的情況是上面的1、4同時(shí)出現(xiàn)，那真是要把人氣死?。?！至于說(shuō)拖尾，刺峰等等都很常見(jiàn)。而且首先大概就是考慮柱子效率下降了或者壞了。呵呵?。。?
5、樣品濃度多少才不算低？0.8mg/ml的蛋白質(zhì)濃度算不算低。我不太想用透析袋濃縮，那樣會(huì)丟失好多樣品。想直接加樣，洗脫。還有，上樣體積問(wèn)題？2.6*96cm 柱子，上100ml 的樣品怎么樣？zui后一個(gè)問(wèn)題，樣品中含有少量edta會(huì)不會(huì)有影響？

1、如果是離子交換，上樣濃度太大反而不好，這樣子動(dòng)態(tài)載量會(huì)減小；
2、如果是凝膠層析，上樣濃度要盡量大些，道理和電泳一樣，樣品在跑的過(guò)程中不可避免地會(huì)被稀釋，變得"broad"，雜質(zhì)和目標(biāo)蛋白的洗脫峰就有更多的部分重疊，影響純度。
3、關(guān)于凝膠層析的上樣量，通常是柱體積的2－5％，太多會(huì)影響分離效果。你的上樣量顯然太大了。在現(xiàn)有條件下，可以通過(guò)連續(xù)批次上樣，即不等前次樣品跑出柱子，就第二次上樣，通?？梢宰龅揭粋€(gè)柱體積上兩次樣，這樣子可以節(jié)省時(shí)間和試劑。但要具體摸索。
4、至于量程的設(shè)定，我建議先用緩沖液回零，再用注射器或泵將樣品注入檢測(cè)器，調(diào)至滿刻度，應(yīng)該差不多了。
5、edta 是常用的生物緩沖液的成分之一，它在某些情況下會(huì)影響層析，具體情況具體分析。
6、什么叫連續(xù)批次上樣？具體我應(yīng)該怎么fumble呀，我還從沒(méi)聽(tīng)說(shuō)過(guò)這個(gè)詞呢。還望指教。

一般情況下，上柱的樣品跑出柱子后，根據(jù)紫外或電導(dǎo)或其他檢測(cè)器的情況分部收集完成后，才開(kāi)始第二次上樣，需要用至少一個(gè)柱體積的緩沖液。這種情況下，絕大部分緩沖液是用于將樣品“沖”出柱子，尤其是后半部分的緩沖液。有些浪費(fèi)。這部分緩沖液的*可以再上一次樣品，適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)兩次上樣的間隔，可以做到兩次樣品*分開(kāi)而不會(huì)重疊，從而一個(gè)柱體積的洗脫中可以兩次上樣，節(jié)省試劑，縮短時(shí)間，

即所謂“連續(xù)批次”。這是相對(duì)通常情況下而言的。
7、例子：樣品是用10mMTris-Cl,pH7.4（含10mMEDTA）,而流洗緩沖是30mMTris-Cl,pH7.9,我自己認(rèn)為這樣應(yīng)該不會(huì)有太大影響吧，希望有知情者告知。好讓我下次改正。
分析：根據(jù)你的描述，看來(lái)你是在用Sephadex 26/100做凝膠層析。

1、凝膠層析主要用途有兩個(gè)，一個(gè)是在其分辨率范圍內(nèi)根據(jù)分子大小進(jìn)行分離，常用于蛋白質(zhì)純化的zui后一步，即精細(xì)純化（polishing），由于樣品體積明顯影響分離速度和分辨率，故很少用于粗提純。另一個(gè)用途是脫鹽/緩沖液置換，即將蛋白或其他大分子量的組分與無(wú)機(jī)鹽等小分子組分分開(kāi)。常用于不同層析步驟之間的緩沖液置換，使得樣品與待使用的緩沖液成分盡量一致。目前Amersham公司的填料中Sephadex G25較常用于這方面。
2、如果你的凝膠柱子用于蛋白質(zhì)的分離純化，如我前所提，分辨率至關(guān)重要。裝柱的效果直接影響分離效果。裝得不好的柱子是對(duì)填料的浪費(fèi)，尤其是用好的凝膠。不知道你是否測(cè)過(guò)這個(gè)柱子的柱效？合格的Sephadex G100柱子的每米理論塔板數(shù)應(yīng)在3000－6000之間。如果低于3000，重裝。

3、平衡也很重要。柱子裝完后，要用和上樣緩沖液盡量相同的緩沖液平衡，流速也與上樣盡量一致，平衡至少5 個(gè)柱體積，讓填料“喝飽”，即流出的液體和進(jìn)的液體成分盡量一致，有時(shí)紫外檢測(cè)器的走線平穩(wěn)并不一定意味著平衡完成即是如此。連續(xù)上樣過(guò)程中，也要適當(dāng)進(jìn)行平衡，比如3－5 次上樣后平衡2個(gè)柱體積，對(duì)柱子的分離效果和壽命都有好處。

8、問(wèn)題：823a型紫外檢測(cè)儀——3057型便攜式記錄儀。我不明白這種組裝是啥道理？是通過(guò)什么信號(hào)使得記錄儀能夠記錄到，由檢測(cè)器檢測(cè)出的信息。所以我在操作時(shí)，不知道怎么調(diào)節(jié)。那些按鈕之間的關(guān)系？

1.短接記錄儀，記錄筆應(yīng)回到機(jī)械零位，否則調(diào)之；
2.接通檢測(cè)器，檢測(cè)器中充滿1mg/ml 的蛋白質(zhì)溶液（如Albumin），調(diào)節(jié)檢測(cè)器的信號(hào)輸出（通常是用電壓標(biāo)識(shí) mv），使記錄筆接近100％滿刻度；
3. 檢測(cè)器中充滿緩沖液，看記錄筆的位置，接近～10％刻度的地方，這樣防止出現(xiàn)吸光度值低于緩沖液無(wú)法記錄的情況；如果筆位太高，應(yīng)增大檢測(cè)器信號(hào)輸出，重新按步驟2 調(diào)節(jié)；反之降低信號(hào)輸出；有的記錄儀也可調(diào)節(jié)輸入信號(hào)的范圍，這樣子就更方便了。滿刻度的調(diào)節(jié)要視具體應(yīng)用，不一定是1mg/ml 的蛋白濃度。
9、about dimension of column:（davidzrock）
"The choice of inner diameter may be based on the desired sample load or on considerations of the extra
dispersion
effects from the wall region,which extends 20 particle diameters away from the wall. ... The length of the column
is primarily chosen according to the resolution that is required."
"The dimensions may be chosen according to the application at hand, but most laboratory columns have a 4- to
16-mm inner diameter（i.d.） and a length of 25 to 70 cm."
-----From ‘Protein Purification principles,High Resolution Methods,and Applications’ 2ed edited by J.C. Janson
and L.Ryden
"The resolution of two separated zones in gel filtration increases as the sequare root of column length. Long
columns should,therefore,be used to obtain the best resolution in analytical fractionation. Bed heights of greater
than 1m are seldom required. If a very long bed is judged to be necessary ,the effective bed height can often be
increased simply by recycling or by using columns coupled in series."
從amersham商品化提供的預(yù)裝柱能看到，沒(méi)有超過(guò)1m的。很長(zhǎng)的柱子裝填難度極大。裝得好的柱子一根可以當(dāng)兩根用。
關(guān)于手工裝柱，取決于裝柱操作者的經(jīng)驗(yàn)，*可以比預(yù)裝柱的效果好，而且可以根據(jù)試驗(yàn)的具體情況改變柱子參數(shù)。但預(yù)裝柱的優(yōu)點(diǎn)是方便、省事，很適合對(duì)柱子和填料進(jìn)行"scaning"。另外工業(yè)化的層析要求是重復(fù)性，“對(duì)人是不信任的”，而不要求的效果，只要滿足要求即可。這時(shí)就要有裝柱設(shè)備（packingstation）了。現(xiàn)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的凝膠層析柱直徑已超過(guò)1m。

10、在室溫下的柱子，怎么保證其膠不發(fā)霉
1.柱子裝填和使用過(guò)程中要注意減少微生物的污染，如對(duì)緩沖液和樣品等進(jìn)行澄清、除菌過(guò)濾。低溫并不能保證無(wú)菌生長(zhǎng)。

2.柱子在使用過(guò)程中，要定期進(jìn)行在位清洗/消毒（SIP/CIP， sanitization/clean in place）。如1M NaOH 處理1hr，可有效地減少微生物污染。具體使用哪種消毒劑以及消毒方法，請(qǐng)參閱凝膠及空柱使用說(shuō)明書，避免損害凝膠柱。如你沒(méi)有，我可幫你查。
3.柱子長(zhǎng)期不用時(shí)，為防止微生物生長(zhǎng)，建議在位保存。如用10mM NaOH或20％乙醇將柱內(nèi)的液體全部置換出來(lái)，存放在建議溫度下（不一定是低溫）。使用前再進(jìn)行沖洗和平衡。也可將凝膠取出，保存于上述溶液中。

4.如有微生物生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行滅菌處理，如1M NaOH 或取出凝膠進(jìn)行高溫滅菌，具體方法亦需事先參閱說(shuō)明書。
From Amersham
Antimicrobial agents for chromatography
Aqueous buffer solutions will often support growth of micro-organisms commonly found in laboratories. Since it is difficult to clean columns that have become heavily contaminated with microorganisms, precautions should be taken to avoid growth in the column or in buffer vessels. Always use fresh buffer solutions and cover the buffer vessels to keep out dust, spores and other particles. If a column will not be used for more than a couple of days, it should be equilibrated with the bacteriostatic agent described in the manual supplied with the separation medium or prepacked column. We recommend ethanol or sodium hydroxide for general use. These agents are effective, inexpensive and do not cause disposal problems. Ethanol 20% Many chromatography media from Amersham Biosciences are supplied as a suspension containing 20% ethanol. Ethanol, 20%, can also be used as an alternative to NaOH for storing chromatography media under bacteriostatic
conditions. It should not be used for columns packed with Sephadex G-types and other media based on Sephadex since the bed will shrink and spoil the packing. Sodium hydroxide Sodium hydroxide, 0.01 M, is an effective bacteriostatic agent. At higher concentrations （0.5-1.0 M） it is an
effective sanitizing agent for contaminated columns. For the most frequent contaminants in chromatographic systems, such as gram-negative bacteria, a good bactericidal effect is reached even at concentrations as low as
0.01 M NaOH. Treatment with sodium hydroxide inactivates endotoxins （LPS） and will, in many cases, solubilize substances precipitated on the column. Its low toxicity is an advantage that reduces the risk of sample contamination. Sodium hydroxide is not recommended for use with Sepharose or for storage of Sephacryl HR.
11、層析關(guān)于裝柱和使用，主要有幾點(diǎn)要注意的：（davidzrock）
1、裝柱前要仔細(xì)看填料的使用說(shuō)明書，每種填料都有自己的特性，以及特殊的裝柱方法，針對(duì)不同的空柱，也要注意方法可能不同；2、填料要加水?dāng)嚢璩删鶆驊乙海瑧乙簼舛纫捞盍隙煌?，一?0－85％，迅速倒入空柱內(nèi)，或吸或壓，流速和具體步驟看說(shuō)明書。
3、這一點(diǎn)非常重要：裝柱包括以后使用中不允許柱內(nèi)進(jìn)入氣泡（bubble free），柱頭事先也要排除氣泡。

4、選擇合適的泵，首先是流速滿足要求，脈沖盡量小。柱塞泵。
5、所有柱子盡量做到填料均勻，尤其是用于凝膠層析的柱子。裝柱完成后，可用柱效測(cè)定的方法檢查裝填效果。一個(gè)裝填合格的柱子的理論塔板高度應(yīng)是填料平均粒徑的2－4 倍，在此范圍內(nèi)越小越好。
6、準(zhǔn)備上柱的液體應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾，至少是0.45micrometre。
7、至于測(cè)序，我想大概不到1mg 應(yīng)該足夠了。
8、關(guān)于純化，首先要考慮的是你的目標(biāo)：純度、數(shù)量、速度、收率等等，再根據(jù)樣品的具體情況，尤其是目標(biāo)蛋白的性質(zhì)，確定純化策略。通常三步曲：capture、purification、polishing。*步先從大量或復(fù)雜樣品中將目標(biāo)蛋白“抓出”，與主要雜質(zhì)分離；再用高選擇性的層析去除絕大部分雜質(zhì)；zui后精細(xì)純化，提供純度至設(shè)定目標(biāo)。到實(shí)際工作中，不要死靠三步，也許一步也許四步或更多，具體情況具體分析。所謂“三步”只是一種思路而已。