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連接反應(yīng)的策略

  　　可以采用幾種策略來(lái)進(jìn)行外源ＤＮＡ片段和質(zhì)粒載體的連接。對(duì)此，可依據(jù)外源ＤＮＡ片段未的性質(zhì)，以及質(zhì)粒載體與外源ＤＮＡ上限制酸切位點(diǎn)的性質(zhì)來(lái)作出選擇。

（一）外源ＤＮＡ片段未的性質(zhì)

帶有各種未的外源ＤＮＡ的克隆方法見(jiàn)下表：

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外源ＤＮＡ片段所帶未端 　　克隆的要求 　說(shuō)明

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平端 　　　要求高濃度的ＤＮＡ和連接酶

1）非重組體克隆的背景可能較高　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

2）質(zhì)粒和外源DNA拼命處的限制酶切位點(diǎn)消失　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

3）重組質(zhì)粒會(huì)帶人外源DNA的串聯(lián)拷貝

用兩種限制酶消化后　 需純化 　

1）質(zhì)粒與外源DNA拼命處的限制酶切位點(diǎn)?？杀Ａ舨煌耐怀龆?br />2）非重組體克隆的背景較低質(zhì)粒體以盡量提高連接效率
3）外源DNA只以一個(gè)方向插入到重組質(zhì)粒中

相同的突出端     線(xiàn)狀質(zhì)粒DNA常用磷酸酶處理

1）質(zhì)粒與外源DNA接合處的限制酶切位點(diǎn)?？杀Ａ?br />2）外源DNA會(huì)以?xún)蓚€(gè)方向插入
3）重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝

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１．帶有非互補(bǔ)突出端的片段
　　用兩種不同的限制酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)突出端的片段，刀就是zui容蜴 克隆的片段。常用的大多數(shù)質(zhì)粒載體均帶有由幾個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn)。由于現(xiàn)有的多克隆位點(diǎn)如此多樣，因而幾乎總是能找到一種帶有與外ＤＮＡ片段未匹配的限制切位點(diǎn)的載體。于是，采用所謂的定向克隆即可將外源ＤＮＡ片段插入到載體當(dāng)中。例如：載體pUC19用BamHl和Hind－Ⅲ進(jìn)行消化，然后，通過(guò)凝膠電泳或大小排阻凝膠層析純化載體大片段，以使同芤下來(lái)的多克隆位點(diǎn) 缺小片段分開(kāi)。于是，這一載體就可以同有與BamHl和ＨindⅢ所切出未端相匹配的粘端的外源ＤＮＡ區(qū)段相連接。用得到的環(huán)狀重級(jí)體化大腸桿菌，檢查氨芐青霉素抗性。由于HindⅢ和BomHI的突出端不互補(bǔ)，載體片段不能有效地環(huán)化，所以轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率也極低。因此，大多數(shù)具有氨芐表霉素抗性的細(xì)菌都含有帶外源ＤＮＡ區(qū)段的質(zhì)業(yè)，外源ＤＮＡ區(qū)段成為連接HindⅢ和BamHI位點(diǎn)的橋梁。當(dāng)然，可以根據(jù)特定的外源ＤＮＡ區(qū)段來(lái)改變限制酶的組合方式。
　　如要制備定向克隆載體，它盡量避免使用大多克隆位點(diǎn)上彼此直接相鄰的限制酶切位點(diǎn)。這些位點(diǎn)中的一個(gè)被切開(kāi)以后，第二個(gè)位點(diǎn)應(yīng)位于線(xiàn)狀ＤＮＡ分子一端的幾個(gè)堿基對(duì)之內(nèi)，這樣過(guò)于靠近末端，不利于多種限制酶的有效切割。正因?yàn)槿绱?，所以?wù)必檢查兩種限制酶對(duì)載體的消化是否*?？刹捎靡韵聝煞N檢查方法： １）用兩種限制酶中的一種對(duì)載體進(jìn)行消化，當(dāng)所用限制酶的zui撻緩沖液對(duì)離子強(qiáng)度的要求有不同時(shí)，應(yīng)使用所要求的鹽濃度較低的酶。消化完后，應(yīng)通過(guò)凝膠電泳對(duì)一小份ＤＮＡ進(jìn)行檢查。如所有質(zhì)粒ＤＮＡ均從環(huán)狀轉(zhuǎn)變?yōu)榫€(xiàn)狀分子時(shí)，適當(dāng)調(diào)整鹽濃度，并加入第二種酶。同時(shí)，另行設(shè)立一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)，其中含有環(huán)狀質(zhì)粒ＤＮＡ，并只加兩種限制酶中的第二種。當(dāng)預(yù)實(shí)驗(yàn)中的所有ＤＮＡ都轉(zhuǎn)變?yōu)榫€(xiàn)狀（由凝膠電泳確定）時(shí)，通過(guò)凝膠電泳或尺墳排阻凝膠層析純化質(zhì)粒ＤＮＡ大片段。par ２）圖1.7所示的是檢查消化反應(yīng)*程度的一種更為嚴(yán)格的方法。對(duì)用*個(gè)限制酶切割的一小份ＤＮＡ進(jìn)行末端標(biāo)記，經(jīng)離盡柱層析法純化后，與未標(biāo)記的線(xiàn)狀ＤＮＡ混合。然后用第二個(gè)酶消化，*消化可使ＤＮＡ小片段釋放，它應(yīng)帶有50％的放射性活度，這可通過(guò)層析或通過(guò)凝膠電泳和放射自顯影加以檢測(cè)。

２。帶有相同末端（平端或粘端）的片段
　　帶有相同末端（平端或粘端）的外源ＤＮＡ片段必須克隆到具有匹配末端的線(xiàn)狀質(zhì)粒載體中。在連接反應(yīng)中，外源ＤＮＡ和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化，也有可能形成串聯(lián)寡聚物。因此，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩個(gè)ＤＮＡ的濃度，以便使“正確”連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到*水平（見(jiàn)本節(jié)三）．此外，常常使用堿性磷酸酶去除5'磷酸基團(tuán)以抑制質(zhì)粒ＤＮＡ的自身連接和環(huán)化。在體外連接反應(yīng)中，僅當(dāng)一個(gè)核苷酸含5'磷酸基團(tuán)而另一個(gè)含3'羥基時(shí)，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶可催化相鄰核苷間形成磷酸二酯健。用細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）或牛小腸堿性磷酸酶（CIP）去除線(xiàn)狀ＤＮＡ兩端的5'磷酸可以zui大限度的地減少質(zhì)粒ＤＮＡ區(qū)段可有效地與去磷酸化質(zhì)粒ＤＮＡ相連接，產(chǎn)生一個(gè)含有兩個(gè)切口的開(kāi)環(huán)分子（圖1.8）。因?yàn)榄h(huán)狀ＤＮＡ（即使是帶切口的環(huán)狀ＤＮＡ）的轉(zhuǎn)化效率比線(xiàn)狀ＤＮＡ高得多，所以大多數(shù)轉(zhuǎn)化體都含有重組質(zhì)粒。

３．帶有平端的片段
　　外源ＤＮＡ片段帶平端時(shí)，還有一樁切外生枝的麻煩事，這就是蛺端的連接效率比起帶有突出互襪末端的ＤＮＡ要低得多。因此，涉及平端分子的連接反應(yīng)所要求的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶的濃度和外源及質(zhì)粒ＤＮＡ的濃度都要高得多。還要說(shuō)明的是，加入低濃度的如聚乙二醇一類(lèi)的物質(zhì)，常可提高這類(lèi)反應(yīng)的效率。 

（二） 質(zhì)粒載體和外源ＤＮＡ中限制酶切位點(diǎn)的性質(zhì)
　　如今，質(zhì)粒載體中限制酶切位點(diǎn)的種類(lèi)極為繁多，因而通常都有可能找到某種帶限制酶切位點(diǎn)恰恰與外源ＤＮＡ片段本身毫無(wú)二致的載體。這就具備一個(gè)不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，也應(yīng)是可以用相應(yīng)的限制酶消化重組質(zhì)粒崦回收外源ＤＮＡ。另一種方案，則是把片段插入到載體中能產(chǎn)生匹配末端的任何位點(diǎn)中。例如，識(shí)別不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ產(chǎn)生具有相同突出末端的限制酶切片段，這樣用BglⅡ消化而制備的外源ＤＮＡ片段可以克隆到用BanHl消化的質(zhì)粒中。這通常會(huì)使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制備載體的任何一種酶所切開(kāi)。然而很多清況下，用切點(diǎn)位于多克隆序列側(cè)翼的限制酶進(jìn)行消化，可將片段從重組質(zhì)粒中摘出。偶爾在質(zhì)粒的以及外源ＤＮＡ兩端的限制酶切位點(diǎn)之間，不可能找到“門(mén)當(dāng)戶(hù)對(duì)”的搭配關(guān)系。這時(shí)可用下面兩種方案加以解決：
１）在線(xiàn)狀質(zhì)粒末端和（或）外源ＤＮＡ片段的末端接上合成在接頭或銜接頭。
２）在得到控制的反應(yīng)條件下，用大腸桿菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分補(bǔ)平帶3'凹端的ＤＮＡ片段。如第九章所討論，這樣常可以使那些不相匹配的限制酶切位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端，從而促進(jìn)載體和外源ＤＮＡ的連接。因?yàn)椴糠盅a(bǔ)平反應(yīng)消除了同一分子兩端彼此配對(duì)的能力，故連接反應(yīng)過(guò)程中環(huán)化和自身寡聚化的機(jī)會(huì)也會(huì)有所降低（Hung和Wensink,1984;Zabarovsky和Allikmets,1986）。  　

連接反應(yīng)

（一）外源ＤＮＡ和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)
　　外源ＤＮＡ片段和線(xiàn)狀質(zhì)粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價(jià)鏈。如質(zhì)粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個(gè)新的磷酸二酯鏈。但如果質(zhì)粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個(gè)新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產(chǎn)生的兩個(gè)雜交體分子帶有２個(gè)單鏈切口（圖1.8），當(dāng)雜本導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。相鄰的５'磷酸和３'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的ＤＮＡ連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌ＤＮＡ連接酶和Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶。實(shí)際上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶都是的用酶。這是因?yàn)樵谙鲁练磻?yīng)條件下，它就能有效地將平端ＤＮＡ片段連接起來(lái)。
　?。模危烈欢伺c另一端的連接可認(rèn)為是雙分子反應(yīng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，其反應(yīng)速度*由互相匹配的ＤＮＡ末端的濃度決定。不論末端位于同一ＤＮＡ分子（分子內(nèi)連接）還是位于不同分子（分子間連接），都是如此?，F(xiàn)考慮一種簡(jiǎn)單的情況，即連接混合物中只含有一種ＤＮＡ，也就是用可產(chǎn)生粘端的單個(gè)限制酶切割制備的磷酸化載體ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反應(yīng)中ＤＮＡ濃度低，則配對(duì)的兩個(gè)末端同一ＤＮＡ分子的機(jī)會(huì)較大（因?yàn)椋模危练肿拥囊粋€(gè)末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。這倦，在ＤＮＡ濃度低時(shí)，質(zhì)粒ＤＮＡ重新環(huán)化將卓有成效。如果連接反應(yīng)中ＤＮＡ濃度有所增高，則在分子內(nèi)連接反應(yīng)發(fā)生以前，某一個(gè)ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ濃度高時(shí)，連接反的初產(chǎn)物將是質(zhì)粒二聚體和更大一些的寡聚體。Dugaiczyk等（1975;同時(shí)參見(jiàn)Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊）從理論上探討了ＤＮＡ濃度對(duì)連接產(chǎn)物性質(zhì)的影響。簡(jiǎn)而言之，環(huán)化的連接產(chǎn)物與多聯(lián)體連接產(chǎn)物的比取決于兩個(gè)參數(shù)：j和i。j是ＤＮＡ分子的一個(gè)末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度，j的數(shù)值是根據(jù)如下一種假設(shè)作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈隨機(jī)卷曲。這樣，j與ＤＮＡ分子的長(zhǎng)度成反比（因?yàn)椋模危猎介L(zhǎng)，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用），因此j對(duì)給定長(zhǎng)度的ＤＮＡ分子來(lái)說(shuō)是一個(gè)常數(shù)，與ＤＮＡ深度無(wú)關(guān)。j＝[3/（3πlb0）]3/2其中l(wèi)是ＤＮＡ長(zhǎng)度，以cm計(jì)，b是隨機(jī)卷曲的ＤＮＡ區(qū)段的長(zhǎng)度。b的值以緩沖液的離子強(qiáng)度為轉(zhuǎn)移，而后者可影響ＤＮＡ的剛度。
i是溶液中所有互補(bǔ)末端的深度的測(cè)量值，對(duì)于具有自身互補(bǔ)粘端的雙鏈dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml這里Ｎo是阿佛伽德羅常數(shù)，Ｍ是ＤＮＡ的摩爾濃度（單位：mol/L）。理論上，當(dāng)j=i時(shí)，給定ＤＮＡ分子的一個(gè)末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下，在反應(yīng)的初始階段中，環(huán)狀分子與多聯(lián)體分子的生成速率相等。而當(dāng)j>i時(shí)，有利于重新環(huán)化；當(dāng)i>j，則有利于產(chǎn)生多聯(lián)體。圖1.9顯示了ＤＮＡ區(qū)段的大小與連接反應(yīng)混合物中j:i之比分別為0.5、1、2和5時(shí)所需ＤＮＡ濃度之間關(guān)系（Ｄugaiczyk等，1985）。 現(xiàn)在考慮如下的連接反應(yīng)混合物：其中除線(xiàn)狀質(zhì)粒之外，還含有帶匹配末端的外源ＤＮＡ片段。對(duì)于一個(gè)給定的連接混合物而言，產(chǎn)生單體環(huán)狀重組基因組的效率不僅受反應(yīng)中末端的濃度影響， 而且還受質(zhì)粒和外源ＤＮＡ末端的相對(duì)濃度的影響。當(dāng)i是j的２－３倍（即末端的濃度足以滿(mǎn)足分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時(shí)）外源ＤＮＡ末端濃度的２倍時(shí)，有效重組體的產(chǎn)量可達(dá)到zui大。這些條什下，連接反應(yīng)終產(chǎn)物的大約40％都是由單體質(zhì)粒與外源ＤＮＡ所形成的嵌合體。當(dāng)連接混合物中線(xiàn)瘃質(zhì)粒的量恒定（j:i=3）而帶匹配末端的外源ＤＮＡ的量遞增時(shí)，這種嵌合體在連接反應(yīng)之末的理論產(chǎn)量。
涉及帶粘端的線(xiàn)狀磷酸化質(zhì)粒ＤＮＡ的連接反應(yīng)應(yīng)包含：
１）足量的載體ＤＮＡ，以滿(mǎn)足j:i>1和j:i<3。對(duì)一個(gè)職pUC18一般大小的質(zhì)粒，這意味著連接反應(yīng)中應(yīng)含有載體ＤＮＡ為20-60μg/ml。
２）未端濃度等于或稍高于載體ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ濃度比載體低得多，在效連接產(chǎn)物的數(shù)量會(huì)很低，這樣就很難別小部分帶重組抽粒的轉(zhuǎn)化菌落。這種情況下，可考慮采用一些步驟來(lái)減少帶非重組質(zhì)粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線(xiàn)狀質(zhì)粒ＤＮＡ或發(fā)跡克隆策略以便通過(guò)定向克隆的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒。 

（二）粘端連接
１）用適當(dāng)?shù)南拗泼赶|(zhì)粒和外源ＤＮＡ。如有必要，可用凝膠電泳分離片段并（或）用堿性磷酸酶處理質(zhì)粒ＤＮＡ。通過(guò)酚：氯仿抽提和乙沉淀來(lái)純化ＤＮＡ，然后用TE（pH7.6）溶液使其濃度為100/ml。
２）按如下所述設(shè)立連接反應(yīng)混合物：
a．將0.1μl載體ＤＮＡ轉(zhuǎn)移到無(wú)菌微量離心管中，加等摩爾量的外源ＤＮＡ。
b．加水至7.5μl，于45℃加溫５分鐘以使重新退炎的粘端解鏈，將混合物冷卻到０℃。
c．加入：10xT4噬菌體ＤＮＡ連接酶緩沖液 １μl
Ｔ４噬菌體ＮＤＡ連接酶 0.1Weiss單位
５mmol/L ATP 1μl
于16℃溫育１－４小時(shí)

10xT4噬菌體ＤＮＡ連接酶緩沖液
200mmol/L同Tris.Cl（pH7.6）
50mmol/K MgCl2
50mmol/L二硫蘇糖醇
500μg/ml牛血清白蛋白（組分Ｖ.Sigma產(chǎn)品）（可用可不用）
該緩訓(xùn)液應(yīng)分裝成小份，貯存于－20℃。
另外，再設(shè)立兩個(gè)對(duì)照反應(yīng)，其中含有（１）只有質(zhì)粒載體；（２）只有外源ＤＮＡ片段。如果外源ＤＮＡ量不足，每個(gè)連接反應(yīng)可用50-100ng質(zhì)粒ＤＮＡ，并盡可能多加外源ＤＮＡ，同時(shí)保持連接反應(yīng)體積不超過(guò)10μl?？捎弥辽伲撤N不同方法來(lái)測(cè)定Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶的活性。大多數(shù)制造廠(chǎng)商（除New England Biolabs公司外）現(xiàn)在都用Weiss等，１1968）對(duì)該酶進(jìn)行標(biāo)化。１個(gè)Weiss單位是指在37℃下20分釧內(nèi)催化１mmol32P從焦磷酸根置換到[γ,β-32P]ATP所需酶時(shí)，１個(gè)Weiss單位相當(dāng)于0.2個(gè)用外切核酸酶耐受試驗(yàn)來(lái)定義的單位（Modrich和Lehman,1970）或者60個(gè)粘端單位（如Ｎew England Biolabs公司所定義）。因此，0.015Ｗeiss單位的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶在16℃下30分鐘內(nèi)可使50％的λ噬菌體HindⅢ片段（5μg）得以連接。在本書(shū)中，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶一律用Weiss單位表示。par 目前提供的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶均為濃溶液（1-5單位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl（pH7.6）、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫蘇糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀釋成100單位/ml的濃度置存。處于這種濃度并在這種緩沖液中的Ｔ４噬體ＤＮＡ連接酶于-20℃保存３個(gè)月可保持穩(wěn)定。
３）每個(gè)樣品各取１－２μl轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

（三）平端ＤＮＡ連接
　?。裕词删wＤＮＡ連接酶不同于大腸桿菌ＤＮＡ連接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的連接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于ＤＮＡ很容易成為平端，所以這是一個(gè)極為有用的酶學(xué)物性。有了這樣的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相連。然而，相對(duì)而言，平端連接是低效反應(yīng)，它要求以下４個(gè)條件：
１）低濃度（0.5mmol/L）的ATP（Ferretti和Sgaranekka,1981）。
２）不存在亞精胺一類(lèi)的多胺。
３）*濃度的連接酶（50Weiss單位．ml）。
４）高濃度的平端。
１．凝聚劑
　　在反應(yīng)混合物中加入一些可促進(jìn)大分子群聚作用并可導(dǎo)致ＤＮＡ分子凝聚成集體的物質(zhì)，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Ｈarrison,1985）或氯化六氨全高鈷（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得適當(dāng)濃度的平端ＤＮＡ的總是迎刃而解。在連接反應(yīng)中，這些物質(zhì)具有兩作用：
１）它們可使平端ＤＮＡ的連接速率加大１－３個(gè)數(shù)量級(jí)，因此可使連接反應(yīng)在酶ＤＮＡ濃度不高的條件下進(jìn)行。
２）它們可以改變連接產(chǎn)物的分布，分子內(nèi)連接受到抑制，所形成的連接產(chǎn)物一律是分子間連接的產(chǎn)物。這樣，即使在有利于自身環(huán)化（j:i=10）的ＤＮＡ濃度下，所有的ＤＮＡ產(chǎn)物也將是線(xiàn)狀多聚體。par 在設(shè)立含凝聚劑的連接反應(yīng)時(shí)，下列資料可供參考。
（１）聚乙二醇（PEG8000）
１）用去離子水配制的ＰＥＧ8000貯存液（40％）分裝成小份，冰凍保存，但加入連接反應(yīng)混合物之前應(yīng)將其融化并使其達(dá)到室溫。在含15％PEG 8000的連接反應(yīng)混合物中，對(duì)連接反刺激效應(yīng)zui為顯著。除PEG 800和Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶以外，其他所有連接混合物的組分應(yīng)于０℃混合，然后加適當(dāng)體積的PEG 8000（處于室溫），混勻，加酶后于20℃進(jìn)行溫育。
２）連接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2時(shí)對(duì)連接反應(yīng)的刺激效應(yīng)zui為顯著，甚至ATP濃度略有增加或ＭgCl2濃度略有降低，都會(huì)嚴(yán)重降低刺激的強(qiáng)度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。
３）濃度為15％的PEG 8000可刺激帶粘端的ＤＮＡ分子的連接效率提高至原來(lái)的10-100倍，反應(yīng)的主產(chǎn)物是串聯(lián)的多聯(lián)體。
４）PEG 8000可刺激短至８?jìng)€(gè)核苷酸的合成寡聚物的平端連接，在這一方面，它與氯化六氨合高鈷有所不同。
（２）氯化六氨合高鈷
１）氯化六氨合高鈷可用水配成10mmol/L貯存液貯存于-20℃，它對(duì)連接反應(yīng)的刺激具有高度的濃度信賴(lài)性。當(dāng)連接反應(yīng)混合物中鹽深度為1.0-1.5μmol/L時(shí)，其刺激作用zui大。氯化六氨合高鈷可使平端連接的效率大約提高到原來(lái)的50W部，但只能使端連接的效率提高到原來(lái)的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。
２）在單價(jià)陽(yáng)離子（30mmol/L KCl）存在下，它對(duì)平端連接仍有一定的刺激作用，但此時(shí)連接產(chǎn)物的分布有所改變。連接產(chǎn)物不再是清一色的分子間連接產(chǎn)物，相反，環(huán)狀ＤＮＡ將點(diǎn)盡優(yōu)勢(shì)。
３）與ＰＥＧ 8000不同，氯化六氨合高鈷不能顯著提高合成寡核苷酸的連接速率。

（四）質(zhì)粒載體中的快速克隆
　　質(zhì)?？寺≈衵ui慢的步驟是所需的外源ＤＮＡ片段和相應(yīng)質(zhì)粒ＤＮＡ區(qū)段的電泳純化，下面的操作方案[由S.Michaelis（個(gè)人通訊）根據(jù)Struhl（1985）的方法修訂而成]是從純化的凝膠中回收瓊脂糖塊，熔化后直接進(jìn)行質(zhì)粒和外源ＤＮＡ的連接。這一方法尋平端連接和粘端連接都同樣奏效，但需大量的連接酶，而且效率要比標(biāo)準(zhǔn)操作方案約低一個(gè)數(shù)量級(jí)。
１）用適當(dāng)?shù)南拗泼赶庠矗模危?，其量?yīng)足以產(chǎn)生約0.2μg的靶片段。反應(yīng)體積應(yīng)為20μl或更小。在另一管中，用相應(yīng)的限制酶消化約0.5μg載體ＤＮＡ，總反應(yīng)體積為20μl或更小。如載體ＤＮＡ帶相同的端，應(yīng)用磷酸處理如下：用限制酶消化*后，加2.5μl 100mmol/L Tris.Cl（pH8.3）、10mmol/L ZnCl2,加0.25單位牛小腸堿性磷酸酶，于37℃溫育30分鐘。
２）通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離目標(biāo)片段。務(wù)*低熔點(diǎn)瓊脂糖灌制凝膠，務(wù)*含溴化乙錠（0.5μg/ml）的１xTAE作為電泳緩沖液而不是常規(guī)的0.5xTBE來(lái)配制凝膠并進(jìn)行電泳。
３）在長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外照射下檢查凝膠，根據(jù)目標(biāo)條帶的相對(duì)熒光強(qiáng)度估計(jì)所含ＤＮＡ的量（見(jiàn)附錄Ｅ）。用刀片切出目標(biāo)條帶，盡可能少瓊脂糖的體積（通常40-50μl）。將切下凝膠片分別放入作好標(biāo)記的各個(gè)微量離心管中。
４）于70℃加熱10-15分釧，使瓊脂糖熔化。
５）合并熔化的小份凝膠并放到加溫至37℃的中一管中，共終體積應(yīng)不超過(guò)10μl,外源ＤＮＡ與質(zhì)粒載體的摩爾比應(yīng)接近２：１。
用另外兩個(gè)管設(shè)立兩個(gè)對(duì)照連反應(yīng)，一個(gè)只含質(zhì)粒載體，另一個(gè)只含外源ＤＮＡ片段。
６）將３個(gè)管于37℃溫育5-10分鐘，然后每管加10μl用冰預(yù)次的２xT４噬體ＤＮＡ連接酶混合物，在瓊脂糖凝固前，充他混勻各管內(nèi)容物，于16℃溫育12-16小時(shí)。
２xT４噬菌體ＤＮＡ連接酶混合物可制備如下：
1mol/L Tris.Cl（pH7.6） 1.0μl
100mmol/L氯化鎂 1.0μl
200mmol/L三硫蘇糖醇 1.0μl
10mmol/L ATP 1.0μl
水 5.5μl
Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶 １Ｗeiss單位
混勻后放置于冰浴上。
７）連接反應(yīng)行將結(jié)束時(shí)，取出貯存于-70的３管各200μl的凍存大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
８）于70℃中熱10-15分鐘重新溶化連接混合物中的瓊脂糖。
９）立即從每管連接混全物中取出５μl加到200μl大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，小心搖晃，快速地混勻內(nèi)容物。從剩下每管連接混合物中分別再取５μl重復(fù)以上步驟，將轉(zhuǎn)化混合物在冰浴上放置30分鐘。
10）完成轉(zhuǎn)化方案的其余各步。

 感受態(tài)細(xì)胞的制備

（一）制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
　　下述操作方案是由Hanahan（1983）提供的，所制備的大腸桿菌DHl、DH5和ＭＭ249感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)物能使每微克超螺旋ＤＮＡ以≥5x108轉(zhuǎn)化菌落的頻率進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其他大多數(shù)大腸桿菌菌株的zui高轉(zhuǎn)化率大約只有前述菌株的1/10-1/5。盡管如此，實(shí)際上對(duì)所有克隆方面的用途來(lái)說(shuō)，這已綽綽有余。一些大腸桿菌菌株（如ＭＣ1061）不適于此法。下列有３個(gè)因素對(duì)于獲得持續(xù)高的轉(zhuǎn)化頻率來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的：
（１）轉(zhuǎn)化緩沖液中試劑的純度 務(wù)必使用所能得到的zui高質(zhì)量的試劑，這些試劑應(yīng)分裝成小份，避光保存于冷處。
（２）細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài) 由于一些不清楚的原因，直接用貯存于-70┴冰凍培養(yǎng)基中的貯存原種搠種而進(jìn)持培養(yǎng)的細(xì)菌，所得到的轉(zhuǎn)化效率zui高，不應(yīng)使用在實(shí)驗(yàn)中的貯存原咱接種崦進(jìn)持培養(yǎng)的細(xì)菌，所得到的轉(zhuǎn)效率zui高，不應(yīng)使用在實(shí)驗(yàn)室中連續(xù)傳代，貯存于４℃或貯存于室溫的培養(yǎng)物。
（３）玻璃和塑料器皿的清潔度 痕量的去污劑或其他化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大地降低細(xì)菌的論效率，所以撥出一批玻璃器皿于制備感受態(tài)細(xì)菌，而不作它用。這些玻璃器皿應(yīng)用手洗刷，再灌滿(mǎn)純水（Ｍilli-Ｑ級(jí)或與其相當(dāng)?shù)募?jí)別），然后高壓滅菌，臨用前方把水倒掉。細(xì)心操作的話(huà)，幾乎總是可以獲得轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細(xì)胞，每微克超螺旋ＤＮＡ可能得到5x107-1x108個(gè)轉(zhuǎn)化菌落。然而甚至經(jīng)驗(yàn)zui為豐富的工作者也不可能保證持有必要用標(biāo)準(zhǔn)的螺旋質(zhì)粒ＤＮＡ制品來(lái)檢測(cè)每一批新的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。制備感受態(tài)細(xì)胞前，先制備一大批黧的螺旋質(zhì)粒ＤＮＡ，分裝成許多小份貯存于-70℃。這些標(biāo)準(zhǔn)制品可用來(lái)檢驗(yàn)每一批新的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，并檢查每一個(gè)實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化效率。設(shè)立這樣一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照后，如果某一次實(shí)驗(yàn)得不到轉(zhuǎn)化菌落，就可以根據(jù)對(duì)照的情況查明宣究竟是感受態(tài)細(xì)菌方面有庇漏，還是ＤＮＡ制品間有差異。分裝的感受態(tài)細(xì)菌可在-70℃保存幾個(gè)月而轉(zhuǎn)效率無(wú)明顯下降。１）用無(wú)菌鉑絲直接蘸取凍存有大腸桿菌ＤＨl株（或ＤＨ５株、ＭＭ249株原種）（貯存于-70℃的凍培養(yǎng)基上，見(jiàn)附錄Ａ），在SOB瓊脂平板表面劃線(xiàn)， 于37℃培養(yǎng)16小時(shí)。將冰凍的細(xì)菌融化，鉑絲在凍存細(xì)菌原種的表面劃過(guò)時(shí)，已帶上足量的細(xì)菌，因此一管凍存細(xì)菌原種可使用多次。
２）將４－５個(gè)分隔良好的菌落轉(zhuǎn)移到１ml含20mmol/L MgSo４的SOB中，菌落直徑為１－２mm。中速振蕩使細(xì)菌分散，然后在1L錐瓶中用30-100ml含20mmol/LMgSO4的SOB稀釋培養(yǎng)物。
３）于37℃將細(xì)菌培養(yǎng)0.5-3.0小時(shí)，為達(dá)到轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞數(shù)務(wù)必少于108細(xì)胞/ml，可每隔20-30分鐘測(cè)定ＯＤ600值來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況。在菌株與菌株之間，ＯＤ600值和每毫升中活細(xì)胞數(shù)間的關(guān)系變化很大，因此有必要通過(guò)測(cè)量特定大腸桿菌菌株的生長(zhǎng)培養(yǎng)物在生長(zhǎng)周期的不同時(shí)相的ＯＤ600值，并將各稀釋度的培養(yǎng)物鋪于無(wú)抗生素的ＬＢ瓊脂平皿以計(jì)算每時(shí)相的活細(xì)胞數(shù)，從而使分光光度讀數(shù)得到標(biāo)化。
４）在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至０℃。
切記：下述所有步驟均需無(wú)菌操作。
５）于４℃用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘， 回收細(xì)胞。
６）倒出培養(yǎng)液，將管倒置１分鐘以使zui后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
７）用約20ml（每個(gè)50ml管）用冰預(yù)冷的轉(zhuǎn)化緩沖液（對(duì)于TFB,見(jiàn)表1.3；對(duì)于FSB，可參見(jiàn)表1，4）輕輕振蕩，重懸沉淀（若制備需立即使用的感受態(tài)細(xì)胞可用TFB:若制備需要貯存于－70℃的感受態(tài)細(xì)胞則用FSB），將重懸細(xì)胞冰浴10分鐘。
８）于４℃用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以4000轉(zhuǎn)．分離心10分鐘，回收細(xì)胞。
９）倒出培養(yǎng)液，將管倒置１分鐘以使zui后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
10）用４ml（每個(gè)50ml管）用冰預(yù)冷的ＴＦＢ或ＦＳＢ輕輕振蕩重懸沉淀。
按步驟11）a給出的操作程序制備立即使用的感受態(tài)細(xì)胞，而步驟11）b制德貯存于-70℃留待以后使用的感受態(tài)細(xì)胞。
11）a.新鮮感受態(tài)細(xì)胞的制備
a）將140μl DnD溶液加到每一懸液的中心，立即輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻懸液，然后在冰上放置15分鐘。
DnD溶液
二硫蘇糖醇（DTT） 1.53g
DMSO 9.0ML
1mol/L乙酸鉀（pH78.5） 100μl
水至 10ML
DnD溶液作可耐受人機(jī)溶劑的Millex SR膜（Millipore）過(guò)濾除菌，將DnD溶液分裝成160μl小份放入0.5ml的無(wú)菌微量離心管中，密封管口，貯存于-20℃。
DMSO的氧化產(chǎn)物，據(jù)推測(cè)可能是二甲硫醚，是轉(zhuǎn)化的掏物。為避免這個(gè)問(wèn)題，應(yīng)購(gòu)買(mǎi)質(zhì)量的DMSO。應(yīng)將所購(gòu)試劑分裝成10ml小份，放入無(wú)菌試管，密封管口，貯存于-70℃。每小份只用１次，用后棄去。１mol/L乙酸鉀（pH7.5）的配法。
b）每管再加140μlDnD溶液，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻之，將懸液置于冰上，再放15分鐘。
c）將小份懸液分裝到冷卻的無(wú)菌聚丙烯管（Falcon 2059,17x100mm）中，將管置于冰上。就大多數(shù)克隆方面的用途來(lái)說(shuō)，50μl感受細(xì)胞懸液已綽綽有余。然而，如需要更大量的轉(zhuǎn)化菌落（如構(gòu)建cDNA文庫(kù)），每小份感受態(tài)細(xì)胞的量可能需要加大些．加入ＤＮＡ后[步驟12）]，于42℃短暫加熱感受態(tài)細(xì)胞[步驟13）]，這是一個(gè)關(guān)鍵步驟，務(wù)必以正確的升溫速度使細(xì)胞加溫到正確的溫度。下面給出的所有時(shí)間和溫度是用Falcon 2059型管獲得的數(shù)據(jù)，其他類(lèi)型的管未必可產(chǎn)生相同的結(jié)果。
b.凍存的感受態(tài)細(xì)胞的制備
a）每４ml重懸細(xì)胞加140 μl DMSO，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻之，將懸液置冰上15分鐘。
b）每份懸液再加140μl DMSO，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻之，重新放入冰浴中。
c）迅速將懸液分裝到冷卻的無(wú)菌的微時(shí)離心管中，封緊管口，沒(méi)入液氮中快速冰凍感受態(tài)細(xì)胞。貯存于-70℃?zhèn)溆?。就大多?shù)克隆方面的用途來(lái)說(shuō)，50μl感受態(tài)細(xì)胞懸液已綽綽有余。然而，如需要更大量的轉(zhuǎn)化菌落（如構(gòu)建cDNA文庫(kù)），每小份感受態(tài)細(xì)胞的量可能需要加大些。
d）需要時(shí)，從-70℃冰箱中取出一管感受態(tài)細(xì)胞，把管握于手民主，融化細(xì)胞。細(xì)胞一經(jīng)融化，立即把管轉(zhuǎn)移至冰浴中，在冰上放置10分鐘。
e）用一冷卻的無(wú)菌吸頭把感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到冷卻的無(wú)菌聚丙烯管中（Falcon2059,17x100mm）中，放置在冰浴上。加入ＤＮＡ后[步驟12）]，于42℃短暫加熱感受態(tài)細(xì)胞[步驟３）]，這是一個(gè)關(guān)鏈步驟，務(wù)必以正確的升溫速度使細(xì)胞如溫到正確的溫度。下面給出的所有時(shí)間和溫度是用Falcon 2059試管獲者的數(shù)據(jù)，其他類(lèi)型的管未必可產(chǎn)生相同的結(jié)果。
12）將ＤＮＡ加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)幾認(rèn)混勻內(nèi)容物。在冰上放置30分鐘。為得到*結(jié)果，ＤＮＡ溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的５％。轉(zhuǎn)化體的數(shù)量相對(duì)于所加入的ＤＮＡ量近妣例地增加，直至系統(tǒng)達(dá)到飽和，盡管感受態(tài)細(xì)胞在不同批次之間有一些差異，50μl感受態(tài)細(xì)胞通?？杀患slng超粒ＤＮＡ所飽和。雖然再加ＤＮＡ也不影響轉(zhuǎn)化體的總產(chǎn)量，但使用過(guò)多的ＤＮＡ將降低系統(tǒng)的效率（以每微克ＤＮＡ所獲轉(zhuǎn)化體的數(shù)量來(lái)衡量）。當(dāng)所轉(zhuǎn)化的ＤＮＡ很難得時(shí)（如用從相對(duì)難得的樣品中提取mRNA而合成的cDNA），這就顯得格外重要。為zui大限度地提高轉(zhuǎn)化菌落的數(shù)目，可把現(xiàn)有ＤＮＡ分置于幾小份感受態(tài)細(xì)胞中，以期系統(tǒng)不致飽和。試驗(yàn)中一定包括下面的對(duì)照：
a.加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)超螺旋質(zhì)粒ＤＮＡ制品的感受態(tài)細(xì)胞。
b.*不加質(zhì)粒ＤＮＡ的感受態(tài)細(xì)菌。
13）將管放入預(yù)加溫到42℃的循環(huán)水浴中放好的試管加架上，恰恰放置90秒，不要搖動(dòng)試管。
14）快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻１－２分鐘。
15）每管加800μl ＳＯＣ培養(yǎng)基（見(jiàn)附錄Ａ）。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育43分釧使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。為zui大限度地提高轉(zhuǎn)化效率，復(fù)蘇期中應(yīng)溫放地?fù)u動(dòng)細(xì)胞（轉(zhuǎn)速225轉(zhuǎn)/分）。
16）將適當(dāng)體積（每個(gè)90m平板達(dá)200μl）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20mmol/L MgSO4和相應(yīng)抗生素的ＳＯＢ瓊脂培養(yǎng)基上。如培養(yǎng)物體積太?。ā?0μl），可再加肉湯培養(yǎng)基，用一無(wú)菌的彎頭玻棒輕輕地將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂到瓊脂平表面。如在一個(gè)90mm平板上鋪200μl以上的感受態(tài)細(xì)胞，應(yīng)離心濃縮細(xì)胞（于室溫用Sorvall SS34轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘），然后用適量SOC輕輕重懸細(xì)胞。如用四環(huán)素抗性作為選擇標(biāo)記，全部的轉(zhuǎn)化混合物可以鋪在一個(gè)單獨(dú)的平皿上（或鋪在軟瓊脂中）。然而如選用氨芐青霉素抗性，則只能將一部分培養(yǎng)物（根據(jù)實(shí)驗(yàn)決定）鋪在單獨(dú)的平皿上，氨芐青霉素抗性菌落數(shù)的曾加與平皿上所加細(xì)菌數(shù)的增加并無(wú)線(xiàn)性比例關(guān)系，這可能是因?yàn)楸豢股貧⑺赖募?xì)胞可釋放生長(zhǎng)抑制物質(zhì)的緣故。par 17）將平板置于室溫直至液體被吸收。
18）倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12-16小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。如檢查氨芐青霉素抗性，用轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪平板時(shí)密度應(yīng)較低（每個(gè)90mm平板不超過(guò)104菌落），于37℃培養(yǎng)平板時(shí)不應(yīng)超過(guò)20小時(shí)。氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體可將β－內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周?chē)鷧^(qū)域中的抗生素。這樣，鋪平板時(shí)懊度太高或培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)對(duì)氨芐青霉敏感的衛(wèi)星菌落。在造反增減基中不用氨芐青霉素而改用羧芐青霉素，以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml，可使情況有所改善，但不能**之。

（二）用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
　　下面的簡(jiǎn)單方案是Clhen等（1972）所用方法的變通方案，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌，這些細(xì)菌可使每微克螺旋質(zhì)粒ＤＮＡ產(chǎn)生5x106-2x107個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，這樣的轉(zhuǎn)化效率足以滿(mǎn)足所有在質(zhì)粒中進(jìn)行的常規(guī)克隆的需要。該方法*適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，并且比方案Ｉ快速，重復(fù)性更好。該法制備的感受態(tài)細(xì)胞可貯存于-70℃，但保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使轉(zhuǎn)化效率在一定程度上受到影響。
１）從于37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（直徑２－３mm），轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100ml LB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約３小時(shí)（旋轉(zhuǎn)搖床，300轉(zhuǎn)/分）。為得到有效轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞數(shù)不應(yīng)超過(guò)108細(xì)胞ml，可每隔20-30分種測(cè)量OD600值來(lái)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況。在菌株與菌株之間，ＯＤ600值和每毫升中活細(xì)胞數(shù)間的關(guān)系變化很大，因此有必要通過(guò)測(cè)量特定大腸桿菌菌株的生長(zhǎng)增減物在生長(zhǎng)周期的不同時(shí)相的ＯＤ600值，并將各黧度的增減物鋪于無(wú)抗生素的ＬＢ瓊脂平皿以計(jì)算每一時(shí)相的活細(xì)胞數(shù)，從而使分光光度讀數(shù)得到標(biāo)化。
２）在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至０℃。切記：下述所有步驟均需無(wú)菌操作。
３）于４℃用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以回收細(xì)胞。
４）倒出培養(yǎng)液，將管倒置１分釧以使zui后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
５）以10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上。我們發(fā)現(xiàn)將１mol/L CaCl2貯存液[用純水（Ｍille-Q級(jí)或與其相當(dāng)?shù)募?jí)別）配制]以10ml小份貯存于-20℃煞是方便。制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，取一小份融化，用純水稀釋至100mlk，用Nalgene濾器（0.45μm孔徑）過(guò)濾除菌，然后驟冷到０℃即可。 對(duì)于大多數(shù)大腸肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在這一步采用TFB（見(jiàn)表1.3）代替氯化鈣可得到相同的或更好的結(jié)果。
６）于４℃以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以回收細(xì)胞。
７）倒出培養(yǎng)液，將管倒置１分鐘以使zui后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
８）每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2[或ＴＦＢ，見(jiàn)表1.3和步驟５）注]重懸每份細(xì)胞沉淀。此時(shí)，可將細(xì)胞分成小份，放于-70℃凍存.在這些條件下，盡管長(zhǎng)期保存后轉(zhuǎn)化效率會(huì)稍有下降，但細(xì)胞仍可保持處于感受態(tài)。Dagert和Ehrlich（1979）曾表明細(xì)胞可以于４℃在CaCl2溶液中保存24-48小時(shí)，在貯存的zui初12-24小時(shí)內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率增加３－５倍，然后降低到初始水平。
９）用冷卻的無(wú)菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，每管加ＤＮＡ（體積∞10μl,ＤＮＡ∞50ng），輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘。
10）將管放到預(yù)加溫到42℃的循環(huán)水浴中放好的試管回上，恰恰放置90秒，不要搖動(dòng)試管。
11）快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻１－２分鐘。
12）每管加800μlＳＯＣ培養(yǎng)基（見(jiàn)附錄Ａ）。用水溶將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45分鐘細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。如果要求更高的轉(zhuǎn)化效率，在復(fù)蘇期中，應(yīng)溫和地?fù)u動(dòng)細(xì)胞（轉(zhuǎn)速不超過(guò)225轉(zhuǎn)/分）。
13）將適當(dāng)體積（每個(gè)90mm平板可達(dá)200μl）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20mmol/L MgSO4和相應(yīng)抗生素的ＳＯＢ瓊脂培養(yǎng)基上。如培養(yǎng)物體積太?。ā?0μl）?？稍偌尤鉁囵B(yǎng)基，用一無(wú)菌的彎頭玻棒輕輕地將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂到瓊脂平板表面。 如在一個(gè)90mm平板上鋪200μl以上的感受態(tài)細(xì)胞，應(yīng)離心濃縮細(xì)胞，然后用適量ＳＯＣ輕輕重懸細(xì)胞。如用四環(huán)素抗性作為選擇標(biāo)記，全部的轉(zhuǎn)化混合物可以鋪在一個(gè)單獨(dú)的平皿上（或鋪在軟瓊脂中）。然而如選用氨芐青霉素抗性，則只能將一部分培養(yǎng)物（根據(jù)實(shí)驗(yàn)決定）鋪在單獨(dú)的平皿上。氨芐青霉素抗性功的增加與平皿上所加細(xì)菌數(shù)的增加并無(wú)線(xiàn)性比例關(guān)系，這可能是因?yàn)楸豢股貧⑺赖募?xì)胞可釋放生長(zhǎng)掏物質(zhì)的緣故。
14）將平板置于室溫直至液體被吸收。
15）倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12-16小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。如檢查氨芐青霉素抗性，用轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪增板時(shí)密度較低（每個(gè)90mm平板不超過(guò)104菌落），于37℃培養(yǎng)平板時(shí)不應(yīng)超過(guò)20小時(shí)。氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化可將β－內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周?chē)鷧^(qū)域中的抗生素。這樣，鋪平板時(shí)密度太高或培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)對(duì)氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落。在選擇培養(yǎng)基中不用氨芐青霉素而改用羧芐青霉素，以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml，可使情況有所改善，但不能**之。