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一、標(biāo)本的采集與處理

（一）標(biāo)本的采集

1、病毒分離標(biāo)本的采集

病毒分離成功與否很大程度上取決于采集標(biāo)本的質(zhì)量，及其保存、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)。多數(shù)標(biāo)本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次為氣管和支氣管分泌物，有時(shí)也采用肺活檢材料等。

標(biāo)本采集后應(yīng)立即放入適當(dāng)?shù)牟蓸右褐械蜏乇４妫Ｓ玫牟蓸右簽椋浩胀ㄈ鉁?，pH7.4-7.6的Hank‘s、Eagle’s或水解乳蛋白液。為防止細(xì)菌和真菌生長，在采樣液中需加入抗菌素，以往抗菌素多用青、鏈霉素，近來發(fā)現(xiàn)不少種類細(xì)菌對(duì)它們具有耐藥性，故近來多用慶大霉素（其終濃度為每ml采樣液中加入0.1 ml的10mg/ml）和抗真菌藥物（終濃度為每毫升采樣液中加入0.008 ml的250ug/ ml）。主要的采集方法有以下幾種：

1）鼻拭子：將棉簽輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出。以同一拭子拭兩側(cè)鼻孔。將棉簽浸入4-5 ml采樣液中，尾部棄去。

2）咽拭子：用棉簽擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，同樣將棉簽頭浸入4-5 ml采樣液中，尾部棄去。注：亦可將鼻、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高分離率，減少工作量。

3）鼻咽抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收集器（國外有售）從鼻咽部抽取粘液。先將收集器頭部插入鼻腔，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液涮洗收集器3次。由于該收集器國內(nèi)難買到，也可采用國內(nèi)一種設(shè)計(jì)裝置（見郭元吉、程小雯著，流行性感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)。中國三峽出版社P186，1997）。

4）鼻洗液：患者取坐姿，頭微后仰，用移液管將1-1.5ml洗液注入一側(cè)鼻孔，囑患者同時(shí)發(fā)K音以關(guān)閉咽腔。然后讓患者低頭使洗液流出，用平皿或燒杯收集洗液。重復(fù)此過程數(shù)次。洗兩側(cè)鼻孔zui多可用10-15 ml洗液。

5）漱口液：用10 ml洗液漱口。漱時(shí)讓患者頭部微后仰，發(fā)“噢聲”，讓洗液在咽部轉(zhuǎn)動(dòng)。然后，用平皿或燒杯收集洗液。

注：取鼻洗液和漱口液時(shí)，需預(yù)先了解患者是否對(duì)抗菌素有過敏史，如有則洗液和含漱液中不應(yīng)含有抗菌素。

2、血清標(biāo)本采集

血清標(biāo)本應(yīng)包括急性期和恢復(fù)期雙份血清。急性期血樣應(yīng)盡早采集，zui遲不超過發(fā)病后7天。恢復(fù)期血樣應(yīng)在發(fā)病后2-4周采集。單份血清一般不能用作診斷。血液標(biāo)本2000-2500rpm離心15min。收集血清，棄血凝塊。血清可在4℃存放一周，長期保存置-20℃。

（二）標(biāo)本運(yùn)送

標(biāo)本應(yīng)在低溫下，24小時(shí)內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。標(biāo)本至實(shí)驗(yàn)室后，病毒分離標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行接種分離，48h內(nèi)能進(jìn)行接種的可置于4℃保存，如未能接種應(yīng)置-70℃或以下保存。     血清標(biāo)本可在4℃存放一周，長期保存置-20℃或以下。

（三）標(biāo)本處理

標(biāo)本至實(shí)驗(yàn)室后，含棉拭子的標(biāo)本，先將棉拭子在管壁反復(fù)擠壓后取出。鼻腔或咽部洗液，用手將裝標(biāo)本的管充分振蕩，將粘液打碎。置4℃待其自然沉淀5-10min，取上清5 ml。上清液可直接接種或低溫保存。

鼻咽漱液或抽取液：用無菌毛細(xì)吸管，在無菌條件下反復(fù)吹打收集的溶液，以便打碎粘液，同樣置4℃待其自然沉淀5-10min，取上清5 ml。上清液可直接接種或低溫保存。

注：如采樣液中尚未加抗菌素，應(yīng)在接種前補(bǔ)加，用量同前，混勻后置4℃ 1-2h后方可接種。

二、病毒分離

病毒分離是流感診斷zui常用和zui可靠的方法之一。多用雞胚來分離流感病毒。近來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)通過雞胚所分離到的流感病毒，其抗原性與原始標(biāo)本的有所不同，而通過MDCK細(xì)胞分離出的，其抗原性與原始標(biāo)本的相似。另外由于“O”相毒株的重現(xiàn)，MDCK等一些細(xì)胞對(duì)“O”相毒株的敏感性大大超出雞胚的敏感性。因此，MDCK等一些細(xì)胞已成為流感病毒分離*的一種宿主系統(tǒng)。MDCK分離的病毒在很多國家尚未批準(zhǔn)用于疫苗生產(chǎn)，因此在病毒分離時(shí)同時(shí)采用雞胚和MDCK細(xì)胞兩套系統(tǒng)。     流感病毒“O”相毒株不凝集雞紅細(xì)胞，故近來在流感病毒鑒定中常用豚鼠或人紅細(xì)胞來代替。然而，該兩種細(xì)胞無細(xì)胞核，沉積慢，一般在紅細(xì)胞凝集及凝集抑制測定中需60分鐘才能觀察結(jié)果，同時(shí)在“U”型孔板中，很難沉積成像眼淚樣的點(diǎn)即當(dāng)中常有小空洞。

（一） MDCK細(xì)胞分離

1、實(shí)驗(yàn)材料

MDCK細(xì)胞

Eagle氏培養(yǎng)液

Hank‘s溶液

0.25%胰酶和Versene消化液

雙抗（青、鏈霉素）或慶大霉素和抗真菌素

胎?；蛐∨Ｑ?/p>

5.6%或7.5%的NaHCO3

細(xì)胞培養(yǎng)液配制

每500 ml Eagle’s 液加： 終濃度

雙抗 5 ml 100U/ml青霉素

100ug/ml鏈霉素

胎?；蛐∨Ｑ?0.1-0.15ml/ml

使用前用NaHCO3 將pH調(diào)至7.4-7.6。

細(xì)胞維持液配制

同培養(yǎng)液，但不含胎牛或小牛血清，而含終濃度為2-3 ug/ ml 胰酶，用前用NaHCO3 將pH調(diào)至7.6-7.7。

注：目前市場上出售已配好的Eagle‘s試劑有兩種：一種已含有谷氨酰胺，另一種不含。如不含，配工作液時(shí)需補(bǔ)加。

2、病毒接種和收獲

1） 在低倍光學(xué)顯微鏡下檢查MDCK細(xì)胞生長狀態(tài)。

2） 成片的細(xì)胞棄生長液，用Hank’s液洗兩遍，將殘余的牛血清洗凈，因牛血清中含有流感病毒非特異性抑制素，會(huì)影響流感病毒的復(fù)制。

3） 每瓶加入接種標(biāo)本0.5-1.0 ml，輕搖細(xì)胞瓶，使標(biāo)本*覆蓋細(xì)胞，置35℃吸附1-2h。

4） 倒掉感染液，再用Hank‘s液洗1-2遍，每瓶加入3 ml維持液，置35℃培養(yǎng)。

5） 次日起每天檢查有無細(xì)胞病變（CPE）。CPE特征為：細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核固縮或碎裂，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞部分或全部脫落。

6） 收獲及紅細(xì)胞凝集活性（HA）檢查

當(dāng)CPE出現(xiàn)+++ ~ ++++號(hào)時(shí)進(jìn)行收獲，收獲之前也可將細(xì)胞凍融1-2次來提高收獲標(biāo)本的病毒滴度。由于無法證實(shí)CPE就是流感病毒所造成。zui后還得看維持液中是否有紅細(xì)胞凝集活性（HA）。用毛細(xì)吸管取維持液3-4滴，放入血凝板孔中，而后加入等容量的1%豚鼠或人紅細(xì)胞，輕搖混之，置室溫或4℃，1h后觀察結(jié)果。出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集的為陽性標(biāo)本，收獲所有維持液進(jìn)行病毒鑒定，也可暫冰存之。有時(shí)將收獲的維持液，離心棄沉渣，上清中加適量無菌甘油或明膠或1%牛血清白蛋白凍存之。

由于維持液中無牛血清，同時(shí)含一定量的胰酶和NaHCO3，故不應(yīng)在4℃保存，否則易造成HA活性丟失和pH變高。如有清晰的CPE，但HA陰性應(yīng)進(jìn)行盲傳。

注：維持液中加適量胰酶的目的是為了提高流感病毒在細(xì)胞中的復(fù)制能力。絕大多數(shù)流感病毒只有血凝素（H）是裂解型的才具有感染性。細(xì)胞培養(yǎng)不像雞胚，它的維持液中不含有蛋白水解酶，無法將病毒粒非裂解型的HA0 變成裂解型的HA1+HA2。故必須在維持液中加入適量的胰酶。CPE出現(xiàn)時(shí)間隨感染病毒的型別，甚至毒株的差異以及感染量的大小而異。一般標(biāo)本接種后7天還不出CPE，維持液中又查不出HA活性，可認(rèn)為陰性標(biāo)本，棄之。

7）傳代及盲傳

如收獲的維持液HA滴度不高或量不夠用于鑒定，需在MDCK細(xì)胞或雞胚中傳代，把HA滴度提高或量增多。如HA可疑，細(xì)胞CPE清晰，此時(shí)應(yīng)在MDCK細(xì)胞上盲傳一代，如仍測不出HA，可認(rèn)為是陰性。如仍有清晰的CPE并能排除細(xì)菌所引起也可認(rèn)為是非流感病毒。

3、MDCK細(xì)胞傳代

（1） 把需用的溶液置室溫或37℃水浴中預(yù)熱。

（2） 已成片的MDCK細(xì)胞，將其生長液倒掉。

（3） 把Versene與0.25%胰酶按7：1比例配成消化液，每小瓶加入消化液3 ml（加入量應(yīng)根據(jù)瓶大小不同而異）。

（4） 置37℃恒溫箱5-10min，在此期間應(yīng)在光學(xué)顯微鏡下觀察1-2次，當(dāng)細(xì)胞變圓，細(xì)胞與細(xì)胞間互不相聯(lián)，表明消化時(shí)間已到。如細(xì)胞仍連成片，表明消化時(shí)間未到。但千萬不可消化時(shí)間過長，造成大量細(xì)胞從瓶壁上脫下，甚至造成破碎。

（5） 倒掉消化液，每瓶加入9 ml培養(yǎng)液，用毛細(xì)吸管將瓶壁上細(xì)胞輕輕吹下吹散。

吸出6 ml接種2小瓶，3 ml/瓶，將原瓶留下，置37℃恒溫箱培養(yǎng)。

（7） 一般情況下，1瓶細(xì)胞傳3瓶，如細(xì)胞急用，可一傳二。不急用，可一傳四等。有時(shí)為了控制細(xì)胞的代數(shù)，可一傳八，這樣一星期傳一代就可以了。一般情況每2-3天需傳一代。

4、MDCK細(xì)胞保存及復(fù)蘇

MDCK細(xì)胞對(duì)流感病毒的敏感性隨其代數(shù)增加而下降，故各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用液氮凍存代數(shù)較低的細(xì)胞作為種子。一般保存液為含10%二甲基亞砜和90%小牛血清。

（1）MDCK細(xì)胞保存

將單層細(xì)胞消化分散成為單細(xì)胞；加入0.9 ml小牛血清和0.1 ml二甲基亞砜；相混收集于保存小管中；緩慢凍存：放4℃2h，轉(zhuǎn)放-20℃2h，再轉(zhuǎn)放液氮中長期保存，也可置-70℃短期保存。

（2）MDCK細(xì)胞復(fù)蘇

細(xì)胞凍存管從液氮罐取出后，速放37℃水浴溶化，溶化后加入3 ml培養(yǎng)液，混均后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃CO2孵箱培養(yǎng)。

（3）MDCK細(xì)胞對(duì)流感病毒敏感性測試

前面提到MDCK細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性隨其代數(shù)增加而下降。故MDCK細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室傳20代以上時(shí)，一般需測試一下其對(duì)流感病毒的敏感性。其具體測試方法：選一株對(duì)MDCK細(xì)胞較敏感的流感病毒株，為當(dāng)前在人群中流行的甲型流感病毒。在同一條件下，用早代與要測試的MDCK細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行TCID50測定。如果測試的TCID50比早代的低2個(gè)或以上Lg，表明其對(duì)病毒的敏感性已下降，不應(yīng)繼續(xù)使用；如果兩者相差不超出一個(gè)Lg，表明可繼續(xù)使用。