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BCA蛋白定量試劑盒使用說明書
閱讀：967 發(fā)布時間：2019-4-10BCA蛋白定量試劑盒使用說明書
【產(chǎn)品組成】
Component | SBJ-1001S 250T | SBJ-1001M 500T | Store at |
試劑(A):BCA試劑A | 50ml | 100ml | 室溫,避光 |
試劑(B):BCA試劑B | 1.5ml | 3ml | 室溫 |
試劑(C):蛋白標準(BSA) | 20mg | 20mg | 室溫 |
試劑(D):蛋白標準配制液 | 5ml | 10ml | 室溫 |
【保存條件】
室溫,避光,6個月
【產(chǎn)品概述】
目前世界上常用的蛋白濃度檢測方法是：BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)和Bradford蛋白定量試劑盒(Bradford Protein Assay Kit)。BCA法與傳統(tǒng)方法相比，更簡單、更穩(wěn)定、更靈敏度。BCA法測定蛋白濃度兼容性亦很好，不受大部分樣本中其他成分的影響，對于5%以內(nèi)的SDS、TritonX-100、Tween20、Tween80具有很好的兼容性,但BCA法測定蛋白濃度易受螯合劑、高濃度的還原劑等的影響，在BCA法測定蛋白濃度前應盡量使：EDTA濃度≤m10M，DTT濃度≤1mM，2-ME≤0.01%。
BCA Protein Assay Kit在50～1000μg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關系，其小檢出量為25μg/ml。本試劑盒僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。
【使用方法】
1、取1ml蛋白標準配制液*加入到含有20mg的蛋白標準(BSA)中，充分溶解，后配制成20mg/ml的蛋白標準溶液，配制后可立即使用，配制的蛋白標準溶液應-20℃保存。
2、取適量的20mg/ml蛋白標準溶液，稀釋至終濃度為500μg/ml或所需濃度。如取25μl20mg/ml蛋白標準，加入975μl稀釋液，充分混勻，即配制成500μg/ml蛋白標準溶液。特別提示：待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標準也宜溶解于什么樣的稀釋液中，例如待測蛋白溶解于蔗糖中，亦取20mg/ml蛋白標準溶解于蔗糖中。一般也可以用0.9%NaCl或PBS作為溶解BSA稀釋液，稀釋后的500μg/ml蛋白標準溶液也應-20℃長期保存。
3、根據(jù)樣品數(shù)量，按試劑(A):試劑(B)=50:1的比例配制BCA工作液，即取50份BCA試劑A和1份BCA試劑B，充分混勻，即獲得BCA工作液。例如取5mlBCA試劑A和0.1ml BCA試劑B，配制成5.1ml BCA工作液，BCA工作液室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。
4、將500μg/ml蛋白標準溶液按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板或EP管中，加稀釋液補足至20μl，其蛋白標準濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500μg/ml。
5、加20μl待測蛋白到96孔板或EP管中，如果樣本不足20μl，用稀釋液補足至20μl。注意：如果標準品稀釋液與溶解待測蛋白的溶液不同，應在待測蛋白中加入20μl稀釋液；如果標準品稀釋液與溶解待測蛋白樣本的溶液相同，無需在待測蛋室溫白樣本孔中加入20μl稀釋液，以減少不同溶液的差異。
6、各孔或管加入200μl配制好的BCA工作液，37℃孵育20～30min。
7、酶標儀或分光光度計測定562nm波長處吸光度(如無562nm，540～595nm之間的波長也可)，各孔或管吸光度減去用未加500μg/ml蛋白標準溶液的吸光度，以求得的差值為縱坐標，以標準孔或管中蛋白濃度(μg/ml)為橫坐標，得出標準曲線及回歸方程，根據(jù)標準曲線計算出待測樣品的蛋白濃度。
【注意事項】
1、蛋白標準(BSA)粉末溶解于蛋白標準配制液后，即獲得蛋白標準原液，該原液中含有防腐劑，不影響后續(xù)檢測，該蛋白標準原液-20℃長期保存。
2、待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標準也宜溶解于什么樣的稀釋液中，否者待測蛋白與蛋白標準中所含非蛋白成分不一致，有可能導致測定不準確。
3、如果檢測效果不佳，可以室溫放置2h或60℃放置30min，顏色會隨著時間的延長不斷加深。顯色反應也會隨溫度升高而加快；如果濃度較低，可以適當延長孵育時間或在較高溫度下孵育。
4、測定標準曲線時發(fā)現(xiàn)隨著標準品濃度的增加吸光度或顏色沒有明顯變化，可能的原因是樣品中含有嚴重干擾BCA法測定蛋白濃度的物質(zhì)。
5、BCA法檢測中樣本中不應含有EGTA，否則影響檢測結果。
6、因BCA法測定時顏色會隨著時間的延長不斷加深，建議每次測定時都做標準曲線，并且顯色反應的速度和溫度有關，所以除非控制顯色反應的時間和溫度，否則每次都做標準曲線。
7、如果沒有酶標儀，也可以使用普通分光光度計測定，但應考慮根據(jù)比色皿的小檢測體積。應按比例適當加大BCA工作液的用量使總體積不小于小檢測體積，樣品和標準品的用量亦相應按比例放大；使用分光光度計測定蛋白濃度時，可以測定的樣品數(shù)量可能會顯著減少。
8、為了加快BCA法測定蛋白濃度的速度可以適當加熱，但是切勿過熱，否則易失效。