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發(fā)酵工業(yè)中微生物菌種的退化原因與復(fù)壯方法

菌種的退化與復(fù)壯

1.菌種的退化現(xiàn)象

隨著菌種保藏時(shí)間的延長(zhǎng)或菌種的多次轉(zhuǎn)接傳代，菌種本身所具有的優(yōu)良的遺傳性狀可能得到延續(xù)，也可能發(fā)生變異。變異有正變異（自發(fā)突變）和負(fù)變異兩種，其中負(fù)變異即菌株生產(chǎn)性能的劣化或有些遺傳標(biāo)記的丟失，又稱為菌種的退化。但是在生產(chǎn)實(shí)踐中，必須將由于培養(yǎng)條件的導(dǎo)致菌種形態(tài)和生理上的變異與菌種退化區(qū)別開(kāi)來(lái)。因?yàn)閮?yōu)良菌株的生產(chǎn)性能是和發(fā)酵工藝條件緊密相關(guān)的，若培養(yǎng)條件發(fā)生變化，如培養(yǎng)基中缺乏某些元素，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)孢子數(shù)量減少，也會(huì)引起孢子顏色的改變。溫度、pH的變化也會(huì)使發(fā)酵產(chǎn)量發(fā)生波動(dòng)等，但只要條件恢復(fù)正常，菌種原有性能就能恢復(fù)正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。

常見(jiàn)的菌種退化現(xiàn)象中，易覺(jué)察到的是菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)和生理等多方面的改變，如菌落顏色的改變、畸形細(xì)胞的出現(xiàn)等；菌株生長(zhǎng)變得緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少直至產(chǎn)孢子能力喪失，例如放線菌、莓菌在斜面上多次傳代后產(chǎn)生“光禿"現(xiàn)象等，從而造成生產(chǎn)上用孢子接種的困難；菌種代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主的寄生能力明顯下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗生素發(fā)酵單位的減少，枯草芽孢桿菌產(chǎn)能力的衰退等。所有這些都對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)不利。因此，為了使菌種的優(yōu)良性狀延續(xù)下去，必須做好菌種的復(fù)壯工作，即在各菌種的優(yōu)良性狀沒(méi)有退化之前，定期進(jìn)行純種分離和性能測(cè)定。

2.菌種退化的原因

菌種退化的主要原因是相關(guān)基因發(fā)生了負(fù)突變。當(dāng)控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變，就會(huì)引起產(chǎn)量下降；當(dāng)控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變，則使菌種產(chǎn)孢子性能下降。般而言，菌種的退化是個(gè)從量變到質(zhì)變的逐步演變過(guò)程：開(kāi)始時(shí)，在群體中只有個(gè)別細(xì)胞發(fā)生負(fù)突變，這時(shí)如不及時(shí)發(fā)現(xiàn)并采用有效措施而是味移種傳代，就會(huì)造成群體中負(fù)突變個(gè)體的比例逐漸增高，后占優(yōu)勢(shì)，從而使整個(gè)群體表現(xiàn)出嚴(yán)重的退化現(xiàn)象，因此，突變?cè)跀?shù)上的表現(xiàn)依賴于傳代，即菌株處于定條件下，群體多次繁殖，可使退化細(xì)胞在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢(shì)，于是退化性狀的表現(xiàn)就更加明顯，逐漸成為株退化了的菌體。同時(shí)，對(duì)某菌株的特定基因來(lái)講，突變頻率比較低，因此群體中個(gè)體發(fā)生生產(chǎn)性能的突變不是很容易的，但就個(gè)經(jīng)常處于旺盛生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞而言，發(fā)生突變的概率比處于休眠狀態(tài)的細(xì)胞大得多，因此，細(xì)胞的代謝水平與基因突變關(guān)系密切，應(yīng)設(shè)法控制細(xì)胞保藏的環(huán)境，使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，從而減少菌種的退化，

3.防止退化的措施

（1）合理的育種

選育菌種時(shí)所處理的細(xì)胞應(yīng)使用單核的，避免使用多核細(xì)胞；合理選釋誘變劑的種類(lèi)和劑量或增加突變位點(diǎn)，以減少回復(fù)突變；在誘變處理后進(jìn)行充分的后培養(yǎng)及純化突變，以保證保藏藍(lán)種純粹。這些都可有效地防止菌種的退化。

（2）選用合適的培養(yǎng)基

有人發(fā)現(xiàn)用老苜著根汁培養(yǎng)基培養(yǎng)“5406"抗生藍(lán)——細(xì)黃鏈霉菌可以防止它的退化，在赤霉菌產(chǎn)生菌藤倉(cāng)赤霉的培養(yǎng)基中，加入糖蜜、天門(mén)冬素、、5-核苷酸或等物質(zhì)時(shí)，也有防止菌種退化的效果，也可選取營(yíng)養(yǎng)相對(duì)貧乏的培養(yǎng)基作為菌種保藏培養(yǎng)基，如培養(yǎng)基中適當(dāng)限制容易利用的葡萄糖等的添加，因?yàn)樽儺惗喟胧峭ㄟ^(guò)藍(lán)株的生長(zhǎng)繁殖而產(chǎn)生的，當(dāng)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富時(shí)，菌株會(huì)處于旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)，代謝水平較高，為變異提供了良好的條件，大大提高了菌株的退化概率。

（3）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件

在生產(chǎn)實(shí)踐中，創(chuàng)造和發(fā)現(xiàn)個(gè)適合原種生長(zhǎng)的條件可以防止菌種遲化，如低溫、于燥、缺氧等。在棲土曲霉3.942的培養(yǎng)中，有人曾用改變培養(yǎng)溫度的措施（從20~30℃提高到33~34℃）來(lái)防止其產(chǎn)孢子能力的退化。

（4）控制傳代次數(shù)

由于微生物存在著自發(fā)突變，而突變都是在繁殖過(guò)程中發(fā)生的，所以應(yīng)盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到低水平，以降低自發(fā)突發(fā)的概率，菌種傳代次數(shù)越多，產(chǎn)生突變的凝率就越高，因而菌種發(fā)生退化的機(jī)會(huì)就越多。這要求不論在實(shí)驗(yàn)室還是在生產(chǎn)實(shí)踐上，必須嚴(yán)格控制菌種的移種傳代次數(shù)，并根據(jù)菌種保藏方法的不同，確立恰當(dāng)?shù)囊品N傳代的時(shí)間間隔。如同時(shí)采用斜面保藏和其他的保藏方式（真空冷凍于燥保藏、沙土管保藏、液氮保藏等），以延長(zhǎng)菌種保藏時(shí)間。

（5）利用不同類(lèi)型的細(xì)胞進(jìn)行移種傳代

在有些薇生物中，如放線菌和霉菌，由于其細(xì)胞中常含有幾個(gè)核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會(huì)出現(xiàn)不純和衰退的現(xiàn)象，而孢子般是單核的，用它接種時(shí)就沒(méi)有這種現(xiàn)象發(fā)生，有人在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)構(gòu)巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化，而改用子囊孢子移種傳代則不易退化；還有人采用滅過(guò)菌的棉團(tuán)輕巧地蘸取“5406"孢子進(jìn)行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達(dá)到了防止退化的效果。

4.退化菌種的復(fù)壯

退化菌種的復(fù)壯可通過(guò)純種分離和性能測(cè)定等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中種是從退化菌種的群體中找出少數(shù)尚未退化的個(gè)體，以恢復(fù)菌種原有的典型性狀。另種是在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常有意識(shí)地進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性能的測(cè)定工作，以使菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。所以這實(shí)際上是種利用自發(fā)突變不斷從生產(chǎn)中進(jìn)行選種的工作。

其體的菌種的復(fù)壯措施如下。

（1）純種分離

采用平板劃線分離法、平板稀釋法或涂布法均可。把仍保持原有典型優(yōu)良性狀的單細(xì)胞分離出來(lái)，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)恢復(fù)原菌株的典型優(yōu)良性狀，若能進(jìn)行性能測(cè)定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長(zhǎng)良好的單細(xì)胞或單孢子分離出來(lái)，經(jīng)培養(yǎng)恢復(fù)原菌株性狀。

（2）通過(guò)宿主進(jìn)行復(fù)壯

寄生型數(shù)生物的退化菌株可接種到相應(yīng)宿主體內(nèi)以提高菌株的活力，

（3）聯(lián)合復(fù)壯

對(duì)退化菌株還可用高劑量的紫外線輻射和低劑量的DTG聯(lián)合處理進(jìn)行復(fù)壯。