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濕熱滅菌法比干熱滅菌法更有效。濕熱滅菌是利用熱蒸汽滅菌。在相同溫度下，濕熱的效力比干熱滅菌好的原因是：①熱蒸汽對細(xì)胞成分的破壞作用更強。水分子的存在有助于破壞維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的氫鍵和其他相互作用弱鍵，更易使蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)含水量與其凝固溫度成反比(表2-1)；②熱蒸汽比熱空氣穿透力強，能更加有效地殺滅微生物：③蒸汽存在潛熱．當(dāng)氣體轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w時可放出大量熱量，故可迅速提高滅菌物體的溫度。

多數(shù)細(xì)菌和真菌的營養(yǎng)細(xì)胞在60℃左右處理15min后即可殺死，酵母菌和真菌的胞子要耐熱些，要用80℃以上的溫度處理才能殺死，而細(xì)菌的芽胞更耐熱，一般要在120℃下處理15min才能殺死。濕熱滅菌常用的方法有常壓蒸汽滅菌和高壓蒸汽滅菌。

表2-1　蛋白質(zhì)含水量與其凝固溫度的關(guān)系

(一)常壓蒸汽滅菌

    (1)常壓蒸汽滅菌是濕熱滅菌的方法之一，在不能密閉的容器里產(chǎn)生蒸汽進行滅菌。在不具備高壓蒸汽滅菌的情況下，常壓蒸汽滅菌是一種常用的滅菌方法。此外，不宜用高壓蒸煮的物質(zhì)如糖液、牛奶、明膠等，可采用常壓蒸汽滅菌。這種滅菌方法所用的滅菌器有阿諾氏(Aruokd)滅菌器或特制的蒸鍋，也可用普通的蒸籠。由于常壓蒸汽的溫度不超過100℃，壓力為常壓，大多數(shù)微生物的營養(yǎng)細(xì)胞能被殺死，但芽胞細(xì)菌卻不能在短時間內(nèi)死亡，因此必須采取間歇滅菌或持續(xù)滅菌的方法，以殺死芽胞細(xì)菌，達到*滅菌。

    1)巴氏消毒法  是用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不能進行高溫滅菌的液體的一種消毒方法，其主要目的是殺死其中的無芽胞病原菌(如牛奶中的結(jié)核分枝桿菌或沙門氏菌)，而又不影響其*風(fēng)味。巴氏消毒法是一種低溫消毒法，具體的處理溫度和時間各有不同，一般在60-85℃下處理15-30min。具體的方

法可分兩類，*類是較老式的，稱為低溫維持法，例如在63℃下保持30min可進行牛奶消毒；另一類是較新式的，稱為高溫快速法，用于牛奶消毒時只要在85℃下保持5min即可。但是巴氏消毒法不能殺滅引起Q熱的病原體--伯氏考克斯氏體(一種立克次氏體)。

    2)間歇滅菌法  又稱分段滅菌法。適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。方法是：將待滅菌的培養(yǎng)基在100℃下蒸煮30-60min，以殺死其中所有微生物的營養(yǎng)細(xì)胞，然后置室溫或20-30℃下保溫過夜，誘導(dǎo)殘留的芽胞萌發(fā)，第二天再以同法蒸煮和保溫過夜，如此連續(xù)重復(fù)3天，即可在較低溫度下達到*滅菌的效果。例如，培養(yǎng)硫細(xì)菌的含硫培養(yǎng)基就應(yīng)用間歇滅菌法滅菌，因為其中的元素硫經(jīng)常規(guī)的高壓滅菌(12l℃)后會發(fā)生熔化，而在100℃的溫度下則呈結(jié)晶狀。

    3)蒸汽持續(xù)滅菌法  微生物制品的土法生產(chǎn)或食用菌菌種制備時常用這種方法。在容量較大的蒸鍋中進行。從蒸汽大量產(chǎn)生開始，繼續(xù)加大火力保持充足蒸汽，待鍋內(nèi)溫度達到100℃時，持續(xù)加熱3-6h，殺死絕大部分芽胞和全部營養(yǎng)體，達到滅菌目的。

    以上三種方法通常是在無高壓蒸汽滅菌條件的地方(如農(nóng)村)使用。

    (2)滅菌過程中應(yīng)注意

    1)使用間歇法或持續(xù)法滅菌時必須在滅菌物里外都達到100℃后開始計算滅菌時間，此時鍋頂上應(yīng)有大量蒸汽冒出。

    2)為利于蒸汽穿透滅菌物，鍋內(nèi)或蒸籠上堆放物品不宜過滿過擠，應(yīng)留有空隙。固體曲料大量滅菌時，每袋以1.5-2.0kg為宜，料袋在鍋內(nèi)用蓖子分層隔開，不能堆壓在一起。

    3)火大水足才能保證蒸汽足，蒸鍋里應(yīng)先把水加足。一次持續(xù)滅菌時，如鍋內(nèi)盛水量不能維持到底．應(yīng)在蒸鍋側(cè)面安裝加水口，以便在蒸煮過程中添水。添水應(yīng)用開水，以防驟然降溫。

    4)間歇法滅菌時應(yīng)在每次加熱后，迅速降溫，然后在室溫放置24h，再第二次加熱。如果降溫慢，往往使未殺死的雜菌大量滋長，反面導(dǎo)致滅菌物變質(zhì)，特別是固體曲料包裝過大時，靠近中心部分更易發(fā)生這種情況。

    5)從使用效果看，分裝試管、三角瓶或其他容器的培養(yǎng)基，因其體積小，透熱快以用間歇法為佳。固體曲料，因其包裝較大，透熱慢，用間歇法容易滋生雜菌變質(zhì)或者水分蒸發(fā)過多，曲料變得不新鮮，影響培養(yǎng)效果，因此使用一次持續(xù)滅菌法較好。

  (二)高壓蒸汽滅菌

    高壓蒸汽滅菌法是微生物學(xué)研究和教學(xué)中應(yīng)用zui廣、效果的濕熱滅菌方法。

    (1)滅菌原理

    高壓蒸汽滅菌是在密閉的高壓蒸汽滅菌器(鍋)中進行的。其原理是：將待滅菌的物體放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)。把鍋內(nèi)的水加熱煮沸，并把其中原有的冷空氣*驅(qū)盡后將鍋密閉。再繼續(xù)加熱就會使鍋內(nèi)的蒸汽壓逐漸上升，從而溫度也隨之上升到100℃以上。為達到良好的滅菌效果，一般要求溫度應(yīng)達到121℃(壓力為0.1MPa)，時間維持15-30min。也可采用在較低的溫度(115℃，即0.075MPa)下維持35min的方法。此法適合于一切微生物學(xué)實驗室、醫(yī)療保健機構(gòu)或發(fā)酵工廠中對培養(yǎng)基及多種器材、物品的滅菌。蒸汽壓力與溫度的關(guān)系如表2-2所示。

在使用高壓蒸汽滅菌器進行滅菌時，蒸汽滅菌器內(nèi)冷空氣的排除是否*極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓；所以當(dāng)水蒸汽中含有空氣時，壓力表所表示的壓力是水蒸氣壓力和部分空氣壓力的總和，不是水蒸氣的實際壓力．它所相當(dāng)?shù)臏囟扰c高壓滅菌周內(nèi)的溫度是不一致的。這是因為在同一壓力下的實際溫度，含空氣的蒸汽低于飽和蒸汽。見表2-3所示。

表2-2　蒸汽壓力與溫度的關(guān)系

由上表看出：如不將滅菌鍋中的空氣排除干凈，即達不到滅菌所需的實際溫度。因此，必須將滅菌器內(nèi)的冷空氣*排除，才能達到*滅菌的目的。

    在空氣*排除的情況下，一般培養(yǎng)基只需在0.1MPa下滅菌30min即可。但對某些物體較大或蒸汽不易穿透的滅菌物品，如固體曲料、土壤和草炭等，則應(yīng)適當(dāng)延長滅菌時間，或?qū)⒄羝麎毫ι?.15MPa保持1-2h。

    (2)滅菌設(shè)備

    高壓蒸汽滅菌的主要設(shè)備是高壓蒸汽滅菌鍋，有立式、臥式(圖2-5)及手提式(圖2-6)等不同類型。實驗室中以手提式zui為常用。臥式滅菌鍋常用于大批量物品的滅菌。不同類型的滅菌鍋，雖大小外形各異。但其主要結(jié)構(gòu)基本相同。

表2-3　空氣排除程度與溫度的關(guān)系