運(yùn)用DGGE搜尋未知突變
DGGE 是基于以下原理,即增加聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)變性劑的濃度會(huì)熔解雙鏈DNA 的不同區(qū)域。當(dāng)溫度達(dá)到zui低熔解度區(qū)域的熔解溫度(Tm) 時(shí),DNA 部分熔解,在凝膠中形成遷移率下降的分支分子(Myers et al.1987)。在均一的運(yùn)行溫度(50—65°C)和尿素與甲酰胺線性變性梯度條件下即形成了變性環(huán)境。梯度以垂直或平行于電泳方向形成。DGGE 是zui靈敏的突變檢測方法,其效率可達(dá)99%(Grompe 1993)。DCode 系統(tǒng)通過以下途徑優(yōu)化DGGE:
- 溫度控制模塊提供45–70°C 內(nèi)的*運(yùn)行溫度
- 系統(tǒng)可運(yùn)行2 塊16 x 16 cm 凝膠或4 塊7.5 x 10 cm 凝膠
- 可選擇的MacMelt 或WinMelt 軟件優(yōu)化了GC 夾及引物的置放
DGGE 的兩種模式。A ,凝膠的變性梯度方向與電泳方向垂直。從原生乳腺癌種擴(kuò)增的p53 基因6 號(hào)外顯子的野生型和突變型等位基因通過垂直DGGE(80V,56°C,2 小時(shí))分離。感謝AL Borresen, Radium Hospital, Oslo, Norway 提供的數(shù)據(jù)。B ,凝膠的變性梯度方向與電泳方向平行。p53 基因8 號(hào)外顯子的野生型和突變型等位基因在8%丙烯酰胺:甲叉(37.5:1) 平行梯度(40–65% 變性劑)凝膠上,1 x TAE 緩沖液, 60°C,150 V,電泳2.5 個(gè)小時(shí)。左泳道,突變型等位基因;中,野生型等位基因;右,突變型與野生型等位基因。
DGGE分離示意圖。所示為一個(gè)變性梯度方向與電泳方向垂直的凝膠,以及一個(gè)有單個(gè)熔解區(qū)域的目標(biāo)序列。野生型和突變型樣品加入到制備孔內(nèi)。在低變性劑濃度時(shí),DNA 片段為雙鏈,但當(dāng)濃度增加時(shí)雙鏈DNA 開始熔解,形成分枝分子。到濃度非常高時(shí),DNA 片段可熔解形成2條單鏈。
運(yùn)用DGGE搜尋未知突變
DGGE 是基于以下原理,即增加聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)變性劑的濃度會(huì)熔解雙鏈DNA 的不同區(qū)域。當(dāng)溫度達(dá)到zui低熔解度區(qū)域的熔解溫度(Tm) 時(shí),DNA 部分熔解,在凝膠中形成遷移率下降的分支分子(Myers et al.1987)。在均一的運(yùn)行溫度(50—65°C)和尿素與甲酰胺線性變性梯度條件下即形成了變性環(huán)境。梯度以垂直或平行于電泳方向形成。DGGE 是zui靈敏的突變檢測方法,其效率可達(dá)99%(Grompe 1993)。DCode 系統(tǒng)通過以下途徑優(yōu)化DGGE:
- 溫度控制模塊提供45–70°C 內(nèi)的*運(yùn)行溫度
- 系統(tǒng)可運(yùn)行2 塊16 x 16 cm 凝膠或4 塊7.5 x 10 cm 凝膠
- 可選擇的MacMelt 或WinMelt 軟件優(yōu)化了GC 夾及引物的置放
DGGE 的兩種模式。A ,凝膠的變性梯度方向與電泳方向垂直。從原生乳腺癌種擴(kuò)增的p53 基因6 號(hào)外顯子的野生型和突變型等位基因通過垂直DGGE(80V,56°C,2 小時(shí))分離。感謝AL Borresen, Radium Hospital, Oslo, Norway 提供的數(shù)據(jù)。B ,凝膠的變性梯度方向與電泳方向平行。p53 基因8 號(hào)外顯子的野生型和突變型等位基因在8%丙烯酰胺:甲叉(37.5:1) 平行梯度(40–65% 變性劑)凝膠上,1 x TAE 緩沖液, 60°C,150 V,電泳2.5 個(gè)小時(shí)。左泳道,突變型等位基因;中,野生型等位基因;右,突變型與野生型等位基因。
DGGE分離示意圖。所示為一個(gè)變性梯度方向與電泳方向垂直的凝膠,以及一個(gè)有單個(gè)熔解區(qū)域的目標(biāo)序列。野生型和突變型樣品加入到制備孔內(nèi)。在低變性劑濃度時(shí),DNA 片段為雙鏈,但當(dāng)濃度增加時(shí)雙鏈DNA 開始熔解,形成分枝分子。到濃度非常高時(shí),DNA 片段可熔解形成2條單鏈。