試劑盒內容及其配制
試劑盒成份(2-8℃保存)96孔配置48孔配置配制96/48人份酶標
板1塊板(96T)半塊板(48T)即用型
塑料膜板蓋1塊半塊即用型
標準品:96IU/ml 1瓶(0.6ml)1瓶(0.3ml)按說明書進行稀稀
空白對照1瓶(1.0ml)1瓶(0.5ml)即用型
標準品稀釋緩沖液1瓶(5ml)1瓶(2.5ml)即用型
生物素標記的抗CA724抗體 1瓶(6ml)1瓶(3.0ml)即用型
親和鏈酶素-HRP 1瓶(10ml)1瓶(5.0ml)即用型
洗滌緩沖液1瓶(60ml)1瓶(30ml)按說明書進行稀釋
底物A 1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型
底物B 1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型
終止液 1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型
自備材料
1.蒸餾水。
2.加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200、500u、1000lul。
3.振蕩器及磁力攪拌器等。
安全性
1.避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡
快用水沖洗。
2.實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3.不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
操作注意事項
1.試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標
準品應丟棄,不可保存。
2.實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。
3.不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。
保質前使用。
4.使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,
避免使用帶金屬部分的加樣器。
5.使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的
各種成份及樣品。
6.洗滌酶標板時應充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應孔
中吸水。
7.底物A應揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長
時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取
OD值。
8.加入試劑的順序應*,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣
。
9.按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
樣品收集、處理及保存方法
1.血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內
毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅
速小心地分離。
2.血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離
心30分鐘去除顆粒。
3.細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4.保存------如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70 ℃保
存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血
清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度
加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
試劑的準備
1.標準品:標準品的系列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋
前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:96IU/ml6號標準
品)原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
48IU/ml5號標準品100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
24IU/ml(4號標準品)100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀
釋液12IU/ml(3號標準品)00ul的4號標準品加入100ul的標準品
稀釋液6.0IU/ml(2號標準品)100ul的3號標準品加入100ul的標
準品稀釋液3.0IU/ml(1號標準品)100ul的2號標準品加入100ul的
標準品稀釋液100U/ml(空白對照)原始濃度不用稀釋直接加入
50ul。
2.洗滌緩沖液(20×)的稀釋:蒸餾水20倍稀釋。
操作步驟
1.使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫,以
免加樣時加入大量的氣泡,產生加樣上的誤差。
2.根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個
標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定,能
使用復孔的盡量做復孔。
3.加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反
應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振
蕩混勻,37℃溫育1小時。
4.甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水
紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次
5.每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分
鐘。
6.每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避
免光照。
8.取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應立即測定結
果。
9.在450nm波長處測定各孔的OD值。
建議使用的實驗方案
標準品濃度(IU/ml)
A 96 96 樣品 樣品 樣品 樣品
樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
B 48 48 樣品 樣品 樣品 樣品
樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
C 24 24 樣品 樣品 樣品 樣品
樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
D 12 12 樣品 樣品 樣品 樣品
樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
E 6.0 6.0 樣品 樣品 樣品 樣品
樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
F 3.0 3.0 樣品 樣品 樣品 樣品
樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
G 0 0 樣品 樣品 樣品 樣品
樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
H 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
結果分析
以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的CA724標準品濃度為橫坐標
(X),做得相應的曲線,樣品的CA724含量可根據其OD值由標準曲線
換算出相應的濃度。
局限
6號標準品以上的結果為非線性的,根據此標準曲線無法得到精確
的結果。
試劑盒性能
1.靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品
線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2.特異性:不與人其它細胞因子反應。
3.重復性:板內、板間變異系數均小于10%。