根據(jù)朗伯-比爾定律，某有色溶液的吸光度A值與其中溶質(zhì)濃度C以及光徑L成正比，即A＝aCL（a為該物質(zhì)的吸光系數(shù)）。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光值可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下的吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。今欲測定葉綠體色素提取液中葉綠素a、b含量，只需測定該提取液在2 個特定波長下的吸光度度值，并根據(jù)葉綠素a與b在該波長下的吸光系數(shù)即可求出各自的濃度。在測定葉綠素a、b含量時，為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長應(yīng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的大吸收峰。
手持葉綠素儀已知葉綠素a、b的80 ％丙酮提取液在紅光區(qū)的大吸收峰分別為663nm 和645nm，又知在波長663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的比吸收系數(shù)分別為82.04 和9.27，在波長645nm下分別為16.75和45.60，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：
A663=82.04Ca +9.27Cb………………（1）
A645=16.75Ca+45.6Cb………………（2）
式中A663、A664分別為波長663nm和645nm處測定葉綠素溶液的吸光度值；Ca、Cb分別為葉綠素a、b的濃度（g/L）。
解聯(lián)立方程（1）、（2）可得以下方程：
Ca=0.0127A663-0.00269A645…………（3）
Cb=0.0229A645-0.00468A663…………（4）
如把葉綠素含量單位由g/L改為mg/L，（3）、（4）式則可改寫為：
Ca（mg/L）=12.7A663-2.69A645…………（5）
Cb（mg/L）=22.9A645-4.68A663…………（6）
葉綠素總量CT（mg/L）=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663……（7）
葉綠素總量也可根據(jù)下式求導(dǎo)
A652=34.5×CT
由于652nm為葉綠素a與b在紅光區(qū)吸收光譜曲線的交叉點(diǎn)（等吸收點(diǎn)），兩者有相同的比吸收系數(shù)（均為 34.5 ），因此也可以在此波長下測定一次吸光度（A652）求出葉綠素總量：
CT（g/L）=A652/34.5
CT（mg/L）=A652×1000/34.5………（8）
因此，可利用（5）、（6）式可分別計(jì)算葉綠素a與b含量，利用（7）式或（8）式可計(jì)算葉綠素總量，對比葉綠素檢測儀測量出來的結(jié)果。
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